This manuscript describes how to conduct (single molecule) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.
T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (µM range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on Förster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.
فهم أكثر عمقا لكيفية تعترف T-خلايا مستضدات يتطلب النظر في المكان المناسب، وهذا هو، داخل المشبك المناعي شكلت بين T-الخلية وAPC. هنا، لا تتحدد حركية ملزمة الجزيئية إلا من خلال الخصائص الكيميائية الحيوية الكامنة الشركاء تفاعل المشاركين ولكن تعتمد إلى حد كبير على المعلمات الخلوية، والتي تشمل قوات الخلوية، والهندسة المعمارية الغشاء والتفاعلات الجانبية بين بروتينات الغشاء فضلا عن القيود المشبك محددة هندسية 3. النهج البيوكيميائية تقتصر في حل السلطة لأنها تتطلب تعطل واحد على الأقل من الأغشية متشابك المعنية. لهذا السبب وضعت منهجية التصوير القائم على الحنق لمراقبة ملزمة من TCR لpMHCs المستضدية 2. هنا زينت T الخلايا مع المؤتلف وتحديدا موقع المسمى TCRβ التفاعلي سلسلة واحدة الأضداد شظية (SCF V) وتواجه خطة ع المدعومة زجاج طبقات ثنائية الدهون (SLBs)، التي ترعى MHC الدرجة الثانية الجزيئات محملة الببتيد الأنتيجين fluorescently المسمى، والجزيئات costimulatory والبروتينات التصاق. متشابك ملزم بين النتائج PMHC TCR وصفت صبغ المسمى الصبغة في الحنق، والتي يمكن رصدها على الجزء الأكبر ومستوى جزيء واحد من قبل إجمالي الداخلية الإسفار التأمل (TIRF) المجهري.
في هذه المقالة شرح ذلك بالتفصيل كيفية الاستفادة SLBs لمعايرة نقاط الاشتباك العصبي T-الخلية، التحقق من سلامتها من خلال T-خلية فحص الكالسيوم تدفق الوظيفي، والسلوك الحنق القياسات بكميات كبيرة ومع حساسية جزيء واحد، وتحليل البيانات التي حصل عليها. وتقدم توصيات إلى إنتاج بروتينات يتفق بشكل صحيح اللازمة لطبقة ثنائية functionalization. للحصول على معلومات أكثر تحديدا بشأن تشكيل طبقة ثنائية والإعداد للمجهر TIRF مناسبة يرجى الرجوع إلى وصول الجمهور النشر إضافي إن الرب المنشورة العودة إلى الوراء 4.
خيمة "> طبيعة SLBsSLBs Functionalizable يمكن أن تتولد بسهولة من الحويصلات unilamellar (سيارات الدفع الرباعي) التي تحتوي على اثنين من الدهون 1-بالميتويل-2-oleoyl-SN-gylcero-3-phosphocholine (قصيرة: POPC، 90-99٪) والتعطيل 1،2-dioleoyl- – glycero-3 – {[N (5-الأمينية-1-carboxypentyl) iminodiacetic حمض] succinyl} (باختصار: DGS NTA ني، 1-10٪). سيارات الدفع الرباعي تنتشر على شرائح زجاجية نظيفة لتشكيل طبقة ثنائية مستو متجاورة 4. يقدم DGS-NTA ني لترسيخ البروتينات الموسومة polyhistidine عبر بوساطة polyhistidine مجمع تشكيل مع الاصطناعية NTA ني التي تحتوي على مجموعة الرأس (الشكل 1A). للجمعية مستقرة واحد يستبدل عادة المجال عبر الغشاء الأصلي والذيل حشوية من البروتين التصاق ICAM-1 وجزيء costimulatory B7-1 مع علامة واحدة تحتوي على اثني عشر histidines (ICAM-1-12H، -12H B7-1) (الشكل 1B) . الطبقة الثانية جزيء IE ك محملة الببتيد يحتوي على اثنين جزءا لا يتجزأ من غشاء (α و β) سلسلة ببتيدالصورة. وعبر الغشاء / المجالات هيولي كل من سلاسل يتعين استبدالها مع علامة تحتوي على ستة histidines كل (IE ك α β 6H 6H أو IE ك -2x6H). وكبديل لذلك، وتوسيع سلسلة α مع اثني عشر histidines وترك المجال خارج الخلية من β-سلسلة غير محدد (مما أدى إلى IE ك α 0H 12H β أو IE ك -12H) يؤدي إلى نتائج مرضية (الشكل 1B).
وضع العلامات الخاصة بالموقع من pMHCs
من المهم أن تسمية PMHC stoichiometrically والموقع خصيصا من أجل أن تكون قادرة على تحويل قياس الحنق الغلة إلى التوازن ملزمة الثوابت ذات مغزى. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق وضع العلامات الكيميائية من الببتيد الاصطناعية التي يتم تحميلها إلى الشق ملزم الببتيد من الموسومة الحامض الاميني المؤتلف MHC الدرجة الثانية الجزيئات 2،5. يتضمن الببتيد جميع المخلفات من حاتمة T-الخلية كما ثالذراع بمثابة-C محطة رابط قصير (GGS)، يليه السيستين (على سبيل المثال في العثة السيتوكروم ج (MCC) الببتيد ANERADLIAYLKQATK- GGSC، يتم وضع علامة على رابط بالخط العريض). ويستخدم هذا السيستين لتسمية الببتيد stoichiometrically مع استخدام المشتقات maleimide صبغ. عند هذه النقطة يجب أن تكرس المزيد من الحيطة للتحقق الكمي صبغ اقتران الببتيد التي تحتوي على السيستين. ويوصى HPLC تنقية للناتج إضافة الببتيد صبغ والتي يجب أن تتبعها electrospray التأين مطياف الكتلة. أي الجماهير سجلت المقابلة لeduct الببتيد (بدون صبغ) تعكس وضع العلامات غير مكتملة. إذا كان هذا صحيحا، يجب أن يخضع الببتيد المنقى HPLC لجولات متتالية من صبغ وضع العلامات حتى يعتبر وضع العلامات الكمي. لاحظ أن MALDI-TOF مطياف الكتلة التي ينبغي تجنبها لهذا الأسلوب ينطوي على أشعة الليزر لعينة التأين. هذا العلاج يتحلل من fluorophores الحساسة المرفقة قبل قراءة الببتيد كتلة الخروج وبالتالي underrepre درجة sents من صبغ الاقتران.
وضع العلامات غير المباشرة حتى الآن في مواقع محددة من TCRs محددة الخلية مع استخدام سلسلة واحدة الأحادية التكافؤ شظايا F V
فإنه لا يزال يشكل تحديا إرفاق الأصباغ إلى الخلية البروتينات المرتبطة سطح الخلايا الحية بطريقة خاصة بالموقع. للتغلب على هذه العقبة لTCRs المعرضة للسطح، وقد تم بناؤها نسخة أحادي التكافؤ سلسلة واحدة (SCF V) من جينات TCRβ الأجسام المضادة وحيدة النسيلة -reactive H57-197 2. التركيب البلوري لهذه الأجسام المضادة في مجمع مع TCR يسمح لتصميم بعقلانية نسخة، حيث يتم استبدال بقايا سيرين على مقربة من محطة سي من الببتيد MHC المرتبطة بها (حيث يتم إرفاق المقابلة الحنق شريك صبغة) ل بقايا السيستين. ثم يقدم السيستين متحولة باعتبارها متقبل لتصريف صبغ (الشكل 2).
منهجيات لتسجيل الحنق
الإقليم الشمالي "> القيم الحنق السائبة هي الأنسب للتحقق من العلاقة بين اختيار المسافات بين صبغ والحنق الكفاءة تقاس في هذه TCR-PMHC نظام 2 ملزمة. وبالإضافة إلى ذلك، والقياسات الحنق السائبة تكشف الاختلافات النوعية والكمية في متشابك الانتماءات TCR-PMHC ( انظر أدناه والقسم بروتوكول 3.2). مقاربات مختلفة لقياس الكفاءة الحنق أدخلت في الأدب 6. وفي يتم تسجيل هذه المادة الحنق عبر(أ) استرداد المانحة بعد متقبل التبييض، وعبر
(ب) توعية الحنق الانبعاثات المتقبلة.
الطريقة الأولى (أ) يتطلب استخدام متقبل الحنق التي يمكن photobleached بسهولة، والجهات المانحة، وهو صامد إلى حد ما. وبالإضافة إلى ذلك فإنه من المهم للتأكد من أن متقبل photobleached لم يعد قادر على تبريد مضان المانحة. كما يتم استخدام قناة الكشف عن نفسها (المانحة) لتقدير، لا تصحيح عوامل لد لا الانحرافات لوني لا بد من النظر فيها، الأمر الذي يجعل هذه المنهجية بسيطة وموثوق بها. ومع ذلك، والقياسات الكمية لا يمكن أن تتكرر على الفور العينة نفسها ولا يمكن تسجيل التغيرات في الحنق على مر الزمن. لتجنب الآثار الناجمة عن الانتشار الجزيئي أو الحركة الخلوية وينبغي أن تهدف خطوة سريعة لتبييض، مما يقلل الوقت يمر بين أول الجهات المانحة الحنق (قبل متقبل تبيض) والحصول على الصور الحنق المانحة الثاني (بعد الحنق متقبل التبييض). فمن نوصي لاستخدام مصدر ضوء ليزر قوية من الحنق متقبل الطول الموجي الإثارة من أجل تقليل الإضاءة وتبيض مرات.
في المقابل، في نهج توعيتهم قياس الانبعاثات الحنق (ب) الجهة المانحة الحنق هو متحمس ويلاحظ انبعاث للمتقبل الحنق في القناة الحنق المتقبلة. يمكن تسجيل التغييرات في إشارة الحنق متقبل مرور الوقت ولكن الانبعاثات من الجهات المانحة الحنق في القناة متقبل الحمراء تحولت (رermed bleedthrough) والحنق متقبل عبر الإثارة عن طريق الإثارة المانحة يجب أن تحدد بدقة وتطرح من تسجيل الحنق قناة المتقبلة. لهذا المقابلة الحنق المانحة والحنق الصور متقبل يجب أن تكون محاذاة مكانيا.
الكشف عن جزيء واحد (سم) الحنق الأحداث
مع استخدام الليزر كمصدر الإثارة، وكاميرا حساسة والموهن الضوضاء TIRF المجهري مضان من fluorophores واحدة يمكن أن تعزى بسهولة مع مرور الوقت. تشبه صحيح للكشف عن أحداث smFRET الجزيئات. ومع ذلك، قد يكون سبب المضاعفات التي الحنق bleedthrough المانحة وعبر إثارة للمتقبل الحنق، والرعاية هكذا عظيمة لابد من اتخاذها عند ضبط الكثافة fluorophore في التجربة smFRET.
في بروتوكول الواردة أدناه (قسم البروتوكول 4) تم اختيار TCR كما الحنق المانحة في وفرة عالية وPMHC كما الحنق متقبل في وفرة منخفضة. للتخفيف FR ET المانحة bleedthrough بما فيه الكفاية، وتزيين 10-30٪ من TCRs مع الفلورسنت SCF V و90-70٪ من TCRs مع غير فلوري SCF V. هنا تم اختيار القناة متقبل الحنق كقناة جزيء واحد لأنه متحد البؤر مع جزيء واحد الحنق القناة. وهذا يساعد على مواءمة الأحداث smFRET مع جزيء واحد الحنق يقبلون، الذي هو أساس التحقق من صحة smFRET.
استخراج متشابك خارج معدلات من خلال القياسات smFRET
photobleaching من كل من الحنق المانحة والحنق متقبل لها ليتم احتساب عند استخراج نصف عمر التفاعلات من جزيء واحد الحنق آثار. عدد ملاحظتها الحنق إشارات في بداية ظهورها بينما واحد الزوج المانحين متقبل N (0) تخفض مع مرور الوقت من قبل كل من غير ملزم للمستقبلات يجند photobleaching من التعقيد و. عدد الباقين على قيد الحياة المجمعات في وقت معين N (ر) ويمكن التعبير رياضيا على النحو التالي:
<p clasالصورة = "jove_content">في إكسب المدى photobleaching من (-t / τ التبييض) يوصف الوقت t نتاج عدد من الملاحظات ن والإضاءة ر الوقت مريضا بسبب الوضع مراقبة غير مستمرة، منفصلة (أي تبيض يحدث فقط أثناء إضاءة ). ضمن exp- المدى الحركي (ر / τ إيقاف) الوقت تي هو نتاج عدد من الملاحظات ن والزمن t تأخر لمراقبة الحنق واحدة (أي غير ملزم الحركي يحدث باستمرار). المعادلة 1 يمكن التعبير عنها على النحو التالي:
وτ المدى التبييض / τ سوء ديسcribes عدد من الملاحظات حتى يحدث التبييض ويعرف كقيمة التوقع <ن التبييض> وظيفتها الأسية. المعادلة 2 يمكن تبسيط النحو التالي:
يتم تحديد القيمة المتوقعة <ن (ر متخلفة)> من عدد الإطارات N (ر) مع ملاحظتها الحنق أحداث بعد وقت ر مباشرة من التجربة. ذلك يعتمد على الوقت القابل للتعيين بين الملاحظات (ر متخلفة) المختار في التجربة والقيم غير معروفة لτ قبالة (معكوس معدل خارج ك إيقاف) و <ن تبييض>، وقيمة توقع عددا من الملاحظات قبل حدوث تبيض .
وهكذا، حساب القيمة المتوقعة <ن (ر متخلفة)> لمدة سنتين على الأقل قيم ر <sub> تأخر يسمح تصميم تجريبي ل<ن تبييض> وτ خارج.
استخراج القيم متشابك 2D-K D من خلال القياسات المأخوذة من الحنق
قياس TCR الإشغال لذلك، أي النسبة بين TCRs المربوطة ومجموع TCRs، أمر أساسي لتحديد القيم متشابك 2D-K D. وفقا لمعادلة 4 هذا المصطلح هو يتناسب طرديا مع قياس الحنق تسفر طالما يخدم TCRs الجهات المانحة الحنق وpMHCs كما يقبلون الحنق.
مع الإشغال = TCR، C = معامل التحويل
C هو ثابت، الذي يعتمد على نظام الحنق وfluorophores استخدامها. ويمكن تجريبيا كما هو مبين أدناه. ويمكن تحويلها إلى 2D-K D وفقا للمعادلة 5 عندماومن المعروف الكثافة الأولية لبروابط TCR قبل إضافة T-الخلايا إلى طبقة ثنائية. هذا هو بسبب كثرة تنقل البروتينات SLB المرفقة وأيضا بسبب SLBs توفير خزان لا ينضب تقريبا بروابط 2.
مع [الأولية PMHC] = كثافة الأولى من PMHC قبل إضافة الخلايا التائية
مع المعادلات 4 و 5 واحد ويمكن الآن بسهولة تحديد متشابك 2D-K D بين TCR وPMHC. ويتم ذلك أكثر موثوق مع القياسات الحنق على أساس الانتعاش المانحة بعد التبييض متقبل (انظر القسم بروتوكول 3.1).
ومع ذلك، لقياس C العلاقة بين شدة الحنق I الحنق (تصحيح للخلفية، الحنق bleedthrough المانحة والحنق متقبل عبر الإثارة) وTCR الإشغال لديها يحدد لاحقا. لهذا، واحديحتاج إلى معرفة نسبة R بين متوسط كثافة مضان من واحد fluorophores TCR المرتبطة الحنق المانحة (على سبيل المثال CY3 أو AF555) ن خ I الحنق المانحة ومتوسط كثافة من جزيء واحد الحنق الأحداث SM I الحنق. R يعتمد على نظام الحنق في السؤال، والمرشحات الانبعاثات والكاميرا المستخدمة للكشف عن مضان.
الإشغال في TCR ويمكن بعد ذلك أن تحدد مباشرة وفقا للمعادلة 6.
مع R = ن خ I الحنق المانحة / SM I الحنق
تقرر R كما 1.45 لنظام H57 scFv- CY3 / PMHC-Cy5 يؤدي إلى:
و= الجزء الأكبر I الحنق / الجزء الأكبر I TCR-CY3 • 1.45
يمكن تحديد العلاقة بين إشغال TCR والعائد الحنق من قبل الحنق المانحة استعادةذ بعد متقبل التبييض. ليتم رسم هذا على حد سواء المعلمات ضد بعضها البعض لعدد من microclusters TCR كما هو مبين في الشكل 4A. والمنحدر من نوبة الخطي يشير إلى عامل التحويل C (من المعادلة 4).
كما هو موضح في الشكل 4A، C يرقى ل(أ) H57 SCF V – CY3 / PMHC-Cy5 نظام الحنق و (ب) تكوين النظام المجهر تطبيقها على 1.995. الإشغال في TCR ويمكن استخلاصه بسهولة كما يلي:
الإشغال TCR ل= الحنق تسفر • 1،995
قياس البروتين البروتين التفاعلات في الموقع المرغوب فيه جدا وخاصة عند التعامل مع التفاعلات تقارب منخفضة مثل TCR-PMHC ملزمة 11. وذلك لأن سعر الفائدة على وكذلك استقرار هذه التفاعلات تتأثر بشكل كبير بسبب الظروف الخاصة التي ملزم تأخذ مكان. النهج التصوير الحد الأدنى الغازية القائم على الحنق وبالتالي من حيث المبدأ مناسبة تماما لمثل هذه المهام، ولكن تنطوي على عدد من العقبات التي لا بد أولا من التغلب عليها. الضوضاء الناتجة عن تألق ذاتي الخلوية يحد من حساسية القياسات وبالتالي يجب أن تبقى في الحد الأدنى. يخدم TIRF المجهري هذه الحاجة بشكل جيد جدا 12 ولكن يتطلب functionalization الزجاج الشرائح، من الناحية المثالية في شكل مستو المدعومة من الزجاج الدهون طبقة ثنائية مزينة البروتينات من اختيار 13-15. ميزة أخرى لنهج reconstitutive جزئيا هو أن المؤتلف شركاء الحنق-طبقة ثنائية المقيمة يمكن أن يكون أكثر من مترركاز المسمى بسهولة في، الموقع محددة بطريقة كمية وعقلانية مع fluorophores أصغر حجما وأكثر إشراقا مما هو ممكن مع خلية البروتينات أعرب السطح. يتم تمييزها TCRs مع المؤتلف SCF V، والتي لا تؤثر الاعتراف T-الخلية، كما تم اختباره سابقا 2. وعلاوة على ذلك، وتكوين البروتين من SLB، على سبيل المثال كثافة pMHCs واختيار عوامل التبعية يمكن تعديلها لاحتياجات الفرد المحددة. لقد قمنا في السابق تجارب مع كثافة pMHCs المحفزة متفاوتة، ولكن لم يتم الكشف عن اختلافات كبيرة في 2D-K قبالة و2D-K D 2.
حتى الآن هنا تم التعامل الاعتراف MHC الدرجة الثانية الجزيئات فقط، وذلك أساسا بسبب طبيعة المشقوق من الببتيد ملزم، وهو مفتوح في كلا طرفي وبالتالي يستوعب الببتيدات أكبر بما في ذلك رابط لمرفق fluorophore. في بعض الحالات يمكن أن يعمل هذا النهج أيضا لوضع العلامات MHC CLASS I الجزيئات 16 ولكن ينبغي أن تؤخذ بحذر شديد للتحقق من استخدامها في التجارب. لا ينبغي أن يؤثر على حساسية الخلايا التائية نحو مستضدات، والتي يمكن قياسها عن طريق فحوصات انتشار خلايا T، فضلا عن PMHC-TCR حركية ملزمة كما تم قياسها في المختبر عن طريق مأكل سطح الرنين من خلال إضافة رابط وfluorophore ل الببتيد. بدلا من ذلك، والطبقة MHC I الجزيئات نفسها يمكن أن توصف بطريقة خاصة بالموقع مع إدخال السيستين المفردة ضمن تسلسل السلسلة الثقيلة (الملاحظات غير منشورة).
مع استخدام المجسات الجزيئية المناسبة أي متشابك تفاعل البروتين البروتين يمكن من حيث المبدأ أن تدرس بطريقة الموصوفة هنا. مثل هذه التحقيقات، على سبيل المثال، يجب أن يكون SCF V الصورة أو تصميم Ankyrin كرر البروتينات (DARPins) 17، الأحادي، وينبغي ربط هدفهم مستقر دون التأثير على التفاعل في المصالح. وبطبيعة الحال، و المعلومات الهيكليةn غير مرغوب فيه للغاية لتصميم التحقيق العقلاني ولكن لا حاجة على الاطلاق. عند وضع زوج جديد من الشركاء الحنق، فمن المستحسن لتسجيل وتحليل الحنق بكميات كبيرة لأول مرة. مواقع الحجز التسمية قد تختلف إلى حد كبير لتعظيم إشارة الحنق وأيضا للتحقق من أن تقاس الحنق عوائد تختلف بناء على المسافة بين الصبغة. مرة واحدة هو الأمثل النظام، جزيء واحد الحنق قد يتم تسجيل الإشارات عن طريق الحد من وسم الشريك الحنق وفرة عالية ل10-30٪ وتبيض الشريك الحنق وفرة منخفضة حتى الجزيئات المفردة للحل في مجال الإضاءة.
أخيرا وتجدر الإشارة ليس أقلها أن SLBs تقريب بعض وليس كل جوانب غشاء البلازما الفسيولوجية. الصفات مثل انحناء الغشاء والمرونة، وتجزئة المجال إعادة ترتيب هيكل الخلية والحركة المحمولة، فضلا عن مجموعة متنوعة عالية من البروتينات وأعرب سطح الغشاء لا يمثله SLBs ولكن قد تؤثر رانه عملية قيد التحقيق. ستحتاج بذل الكثير من الجهد لاستثمارها لإقامة طرائق التصوير التي تسمح برصد تفاعلات البروتين البروتين لقرار جزيء واحد في نقاط الاشتباك العصبي الفسيولوجية، والتي لا يمكن الوصول إليها لتصوير TIRF.
The authors have nothing to disclose.
وأيد MA كتبها زمالة شرودنغر للصندوق النمساوية العلوم (FWF، J3086-B11)، وذلك بفضل ماكس-بلانك جمعية الدعم المالي والإداري. ودعمت GS وJH من صندوق العلوم والتكنولوجيا فيينا (WWTF، LS13-030).
LB-media | Fisher Scientific | 10000713 | bacterial expression |
Sf900 II | Life Technologies | 10227402 | insect cell media for baculo virus production |
Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza) | Fisher Scientific | 10564038 | insect cell media for baculo virus expression |
Sf9 cells | Life Technologies | 11496-015 | cells for virus production and expansion |
High Five Cells | Life Technologies | B855-02 | cells for potein expression |
LB-media | Fisher Scientific | 10000713 | bacterial expression |
Centramate System | Pall | protein concentartion from large volumes | |
Centramate cassette 10kDa cutoff | Pall | OS010T12 | protein concentartion from large volumes |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC900308 | protein concentartion |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC800308 | protein concentartion |
Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL | EMD Millipore | 5123 | protein concentartion |
Äkta pure 25L | GE Healthcare | 29-0182-24 | protein purification |
Superdex 200 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5175-01 | protein purification |
Superdex 75 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5174-01 | protein purification |
Mono Q 5/50GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | protein purification |
Ni Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5318-01 | protein purification |
Tricorn 10/20 column | GE Healthcare | 28-4064-13 | protein purification |
Gilson HPLC system | Gilson | purificationof fluorochrome-coupled peptides | |
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*250mm column size | Agilent | A6000250X212 | purificationof fluorochrome-coupled peptides |
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size | Agilent | A6000050G212 | purificationof fluorochrome-coupled peptides |
Tricorn 10/20 column | GE Healthcare | 28-4064-13 | protein purification |
Gilson HPLC system | Gilson | purificationof fluorochrome-coupled peptides | |
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*250mm column size | Agilent | A6000250X212 | purificationof fluorochrome-coupled peptides |
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size | Agilent | A6000050G212 | purificationof fluorochrome-coupled peptides |
Cy3 maleimide | GE Healthcare | PA23031 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Cy5 maleimide | GE Healthcare | PA25031 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Alexa Fluor 555 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20346 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20347 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Fura-2, AM, cell permeant | Life Technologies | F-1221 | calcium-sensitive dye for cell labeling |
dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 151874 | for dissolving fura-2 am |
Hank's Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium | Fisher Scientific | 10225362 | imaging buffer |
PBS | Life Technologies | 14190-136 | |
Bovine Serum Albumin lyophilized powder | Sigma Aldrich | A2153 | supplement for imaging buffer |
14-4-4S antibody | affimetrix eBioscience | 14-5980-81 | blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR) |
5 ml polypropylene round-bottom tube | Becton Dickinson | FALCON 352063 | |
0.22 μm Ultrafree-MC centrifugal filter unit | EMD Millipore | UFC30GV0S | |
Syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red | Life technologies | T-7279 | |
Microscope for fura-2-based calcium measurements | LEICA | DMI4000B | |
Microscope for (single molecule) FRET measurements | LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS | for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al. | |
planar supported lipid bilayers | for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al. | ||
RPMI 1640, with L-Glutamine | Life Technologies | 11554416 | T-cell media |
non-essential amino acid 100X | Hyclone | SH30238.01 | T-cell media supplement |
penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x | Life Technologies | 12000226 | T-cell media supplement |
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | T-cell media supplement |
mouse interleukin-2 recombinant protein | BPS Bioscience | 90185-B | T-cell media supplement |
Research Grade Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | T-cell media supplement |
Origin (analysis program) | OrigenLab | http://www.originlab.com/ | non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag]) |