The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.
Den zebrafisk har blivit en värdefull genetisk modellsystem för studier av utvecklingsbiologi och sjukdomar. Zebrafisk delar en hög grad av genom-bevarande, liksom likheter i cellulära, molekylära och fysiologiska processer, med andra ryggradsdjur inklusive människa. Under tidig ontogeni, zebrafisk embryon är optiskt transparenta, vilket gör att forskare att visualisera dynamiken i organogenesen med hjälp av en enkel stereo. Mikrokornet implantation är en metod som gör det möjligt för vävnad manipulation genom ändring av faktorer i lokala miljöer. Detta gör det möjligt för forskarna att analysera effekterna av ett obegränsat antal signalmolekyler av intresse, såsom utsöndrade peptider, vid specifika rumsliga och tidspunkter inom det växande embryot. Här har vi detalj ett protokoll för hur man manipulerar och implantat pärlor under tidig zebrafisk utveckling.
Utvecklingsbiologi forskare använder ett brett spektrum av cellulära, molekylära och genetiska metoder för att avslöja de mekanismer som styr hur en organism formas. Bland dessa metoder är vävnad manipulation ett viktigt verktyg för att dechiffrera komplexa frågor om cell öde, cellrörelse, och organisationen av vävnader. Ett sätt att ändra lokala vävnadsmiljöer är genom den kirurgiska tillämpningen av mikrokorn som används för att leverera en fokal källa av proteiner eller andra signalmolekyler 1. Denna typ av experimentell manipulation har i stor utsträckning genomförts i klassiska ryggradsdjur embryologi modeller, såsom grodan och chick 2.
Den zebrafisk har blivit en viktig ryggradsdjur modellorganism för studier av organogenesen och ger också många unika fördelar för sjukdom modellering 3-5 som de delar med hög genetisk bevarande med människor 6. I synnerhet den optiska transparens och exinterna utvecklingen av zebrafisk embryot ger en oöverträffad synvinkel för observation av vävnad ontogeny 3-5. Genomförandet av storskaliga framåt genetiska skärmar har genererat en kraftfull slutförvar av zebrafisk mutantstammar för vidare studier 7,8, och identifieringen av alternativa screening tekniker som effektivt kan genomföras vid förminskad skala i enskilda laboratorier 9,10. Ytterligare experimentellt arbete med zebrafisk har underlättats genom framsteg inom transgena metoder och omvänt genetiska metoder 11,12, samt kemisk genetik 13-15.
Vävnads manipulation tekniker, såsom genomförandet av mikropärlor, inte har varit så stor utsträckning används i zebrafisk, men ändå ge ett användbart verktyg för att ytterligare förstå cellsignalering under utveckling. Mikrokorn implantering har använts för att förhöra processerna för organbildning i zebrafisk näthinnan16,17, hjärta 18, hjärna 19-22, neurallisten 23 och fin 24,25. I dessa och andra studier har pärlor använts under utveckling för att förstå spridningen av signalmolekyler 26, hur övertoningar påverkar cellmigration 27 och axiell mönstring 28. På senare tid har mikropärlor använts för att utvärdera regenereringsmekanismer i zebrafisk vuxna 29. I utvecklingsstudier, till exempel, har zebrafisk microbead arbetsuppgifter som insikter mekanismerna för lem bildning genom studier av bröstfenan 25. Zebrafisk bröstfenan knopp är homolog med forelimb knopp i musen 30 och fågelunge 31. Den ryggradsdjur lem knopp har två viktiga signalnoder: zonen för polariserande aktivitet (ZPA) som fastställer den främre till bakre axeln genom uttrycket av Sonic hedgehog (Shh) och nedströms Hox genmål,och den apikala ektodermala åsen (AER) närvarande vid spetsen av lemmen knopp, som verkar för att etablera proximalt distala identitet av lemmen genom expression av fibroblasttillväxtfaktorer (FGF). Genom att implantera Fgf indränkta mikropärlor i zebrafisk Shh genetiska mutanter, utredare identifierade Fgf som avgörande för utvecklingen av cellcykeln och tillväxt av ryggradsdjur lem 25. Förutom den FGF och Shh signaleringskaskader som etablerar positions identitet, banbrytande studier med chick extremitetsanlag identifierad retinoinsyra (RA) som en molekyl som kan härma verkan av den polariserande regionen att upprätta främre till bakre identitet 32. Dessa experiment inblandade placera små remsor av RA-indränkt Whatman papper i chick lem att bedöma siffra mönstring 32. Vidare har forskare utfört andra eleganta studier som utnyttjar användningen av mikropärlor, celltransplantation och exogenaRA behandlingar i zebrafisk att fastställa att RA verkar för att ge långväga positions ledtrådar inom zebrafisk bakhjäman och mesoderm 28. För närvarande är dock många frågor kvarstår om roller signalering faktorer som Fgf och RA under många aspekter av ryggradsdjur utveckling. De signal effekterna av RA, i egenskap av en morfogen, påverka många organ 33, såsom utvecklings hjärtat 34 och njur stamceller, där RA anger proximala njurceller typ öden 35-39. Ytterligare förståelse för sådana frågor skulle ha stor nytta av experimentella studier med hjälp av vävnad manipulation och mikrokornet implantation tekniker.
Medan färre studier har utförts med microbead implantation i zebrafisk, jämfört med modeller som ungen, de som har genomförts har varit mycket informativ. En orsak till bristen på mikrokorn implantering baserad-forskning i zebrafisk embryot är likely uppfattningen att det finns svåra tekniska utmaningar, baserat på storleken av embryot, som utgör ett hinder för att framgångsrikt utföra sådana manipulationer. Däremot kan microbead implantation i zebrafisk embryon läras med praktik och stöd genom visuell observation av tekniken, och därmed kan drivas som ett sätt att förhöra de mekanismer för utveckling. Här visar vi den exakta tillämpningen av en mikropärla in i zebrafisk embryot, som kan utnyttjas för utförande av en mängd olika analyser på vävnadsbildning och cellulär morfogenes.
Under det senaste århundradet har förståelse för kropp plan mönstring och organ genomgått monumentala framsteg. Vävnadsmanipuleringstekniker var avgörande för att avslöja viktig information om dessa viktiga processer. Genmodifiering är en av de vanligaste metoderna för att fastställa genfunktion, och metoder för mosaik analys, såsom celltransplantation, ger användbara metoder för att förstå autonomi av geners funktion. Microbead implantation ger en annan plats att förhöra hur vissa molekyler förändrar utvecklings dynamik, eftersom denna metod gör det möjligt för forskare att ändra en lokal vävnadsmiljö genom att införa signalmolekyler eller hämmare. En rad olika mikropärlor är kommersiellt tillgängliga, som har varierande storlek och andra fysikaliska egenskaper existerar (t.ex., laddning), så att de kan användas för att för de experimentella betingelserna av intresse. Således, genom att implantera mikropärlor som dränkts i ett protein eller kemical av intresse inom en organism, kan forskarna undersöka lokaliserade effekter under utveckling och hitta samband mellan genen eller molekylen av intresse och särskilt biologiska fenotyp (er).
Studier som en utförs av Wada och kollegor använde microbead implantation för att bedöma effekten av ökad Hedgehog-signalering i skelett mönstring i den främre neurocranium (ANC) i zebrafisk 23. Tidigare studier har visat att Shh är nödvändigt för ANC bildning 14. Använda Shh-belagda mikrokulor forskare upptäckt att denna signal främjar broskbildning i ANC. Den mikrokornet implantationsprocessen användes för att visa en tydlig koppling mellan Hedgehog-signalering och broskbildning i ANC. Ett annat viktigt exempel på denna vävnad manipulation teknik zebrafisk har observerats i studier där forskare undersökt transkriptionskontroll av Erythroblastoma tjugosex (ETS) domän faktörer ETS-besläktad molekyl (ERM) och polyomaförstärkaren aktivator 3 (Pea3) av Fgf signalering under tidig zebrafisk hjärnans utveckling 19. Genom microbead implantation experiment, kunde de visa att FGF8 och Fgf3 ectopically kan aktivera uttryck för erm och pea3. Dessa exempel illustrerar användbarheten av mikrokulor för att ge insikter i de utvecklings mekanismer som samverkar under vävnadsbildning, som kan vara väl kännetecknas av användningen av metoder för att bedöma genuttryck 41. Sålunda kan mikrokorn transplantation vara en genomförbar metod för att utforska andra vävnader, såsom det mellanliggande mesoderm (IM) som ger upphov till njuren. Specifikt, skulle det underlätta njurutvecklingsstudier, för att undersöka hur olika molekyler påverkar nephron segmente 42 och tubulogenesis 43,44, processer som bara ytligt förstås för närvarande. Vidare har mikrokorn implantering börjat användas till avely regenereringsprocesser i zebrafisk 29] och kan anpassas för användning med valfritt antal organregenereringsmodeller, såsom följande laserablation av embryonala vävnader som nefronet 45 eller i samband med metoder som har tagits fram för att utföra forskning med motsvarande vuxna strukturer 46-49. Slutligen har microbead implantation potential att användas i modeller av mänskliga sjukdomar, såsom cancer 50,51 eller vävnadsdegenerering 52,53.
I det nuvarande protokollet visar vi metoden för mikrokorn implantation i zebrafisk embryon, som också har liknande beskrivits av andra forskare, men inte visas genom video protokoll 1. Med minimal praktiken kunde vi att implantera mikropärlor med en ungefärlig hastighet på 8-10 embryon / h, vilket avser genomförbarheten av detta förfarande när forskaren har viss erfarenhet. De resultat som visas häri visar att pärlor av olika dimensions kan implanteras i tidiga skeden, och att med omsorg, kan denna vävnad manipulation teknik implementeras med minimal fysisk störning av embryot. En förbättring som bör betonas är användningen av en whisker / frans verktyget för att placera mikrokornet i embryot. Denna relativt billig och enkel utrustning är ungefär samma diameter som den mikrokornet, är lätt att få tag på och hjälper till att påskynda implantationsprocessen. Den whisker / lash kan kapas till en önskad längd för att producera ett fast men ändå känslig vulst-hanteringsverktyg, beroende på forskarens fingerfärdighet och preferens. Slutligen, medan vi beskrivit här hur man fysiskt manipulera mikropärlor och zebrafisk embryon för att utföra implantation, detta protokoll inte beskriva specifika hanteringsrutiner för olika läkemedel eller peptider. I allmänhet bör kemiskt behandlade mikropärlor implanteras i djuret med opportunism, för att undvika oönskade effekter i andra delar av organismen, och forskare bör vara väl ibildas om eventuella säkerhetsrisker i samband med sådana kemikalier innan inleda sina studier.
Sammanfattningsvis har vi visat en relativt enkel och effektiv microbead implantation metod med ett brett spektrum av tillämpningar som använder material som är lätt tillgängliga i labbet. I slutändan hoppas vi att denna manual kommer att hjälpa forskare med den känsliga naturen hos zebrafisk vävnad manipulation.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH bidrag DP2OD008470.
Sodium Chloride | American Bioanalytical | AB01915 | |
Potassium Chloride | American Bioanalytical | AB01652 | |
Calcium Chloride | American Bioanalytical | AB00366 | |
HEPES | Sigma Life Science | H4034 | |
Penicillin-Streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333-20ML | |
N-Phenylthiourea (PTU) | Aldrich Chemistry | P7629 | |
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricane) | Fluka Analytical | A5040 | |
Borosilicate glass | Sutter Instruments Co. | BF100-50-10 | |
Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Mo. P097 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
250mL Erlenmeyer Flask | Fischer Scientific | FB-500-250 | |
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile | Corning | 430167 | |
60mm x 15mm | VWR | 25373-085 | |
100mm x 15mm | VWR | 25373-100 | |
150mm x 15mm | VWR | 25373-187 | |
Saint-Gobain Chemware Microspatula | Fischer Scientific | 21-401-50B | |
P-1000 Micropipette tips | Fischer Scientific | 2707402 | |
Low Temperature Incubator | Fischer Scientific | 11 690 516DQ | |
Dimethly Sulfoxide | American Bioanalytical | AB00435 | |
Microbeads (45-106 µm) | Biorad | 140-1454 AG1-X8 | |
Microbeads (45 µm) | Polysciences | 7314 | |
Micro Dissecting Tweezer | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
Tungsten Needle | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6065 | |
Capillary tube holder | Globe Scientific Inc. | 51674 |