JoVE Journal > Developmental Biology
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发育生物学

Microbead implantation dans l'embryon de poisson zèbre

Published: July 30, 2015
doi:
10.3791/52943
, ,
1Department of Biological Sciences,University of Notre Dame

Summary

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Abstract

Le poisson zèbre a émergé comme un système de modèle génétique précieux pour l'étude de la biologie du développement et de la maladie. Zebrafish part un haut degré de conservation génomique, ainsi que des similitudes dans les processus cellulaires, moléculaires et physiologiques, avec d'autres vertébrés, y compris les humains. Au cours de l'ontogenèse précoce, embryons de poisson zèbre sont optiquement transparent, ce qui permet aux chercheurs de visualiser la dynamique de l'organogenèse utilisant un stéréomicroscope simple. Implantation microbille est une méthode qui permet la manipulation des tissus par la modification de facteurs dans les environnements locaux. Cela permet aux chercheurs pour analyser les effets d'un certain nombre de molécules de signalisation d'intérêt, tels que des peptides sécrétées, en des points spatiaux et temporels spécifiques au sein de l'embryon en développement. Ici, nous détaillons un protocole pour la façon de manipuler et de perles d'implants pendant le développement du poisson zèbre tôt.

Introduction

Chercheurs en biologie du développement utilisent une vaste gamme de méthodes cellulaires, moléculaires et génétiques pour découvrir les mécanismes qui contrôlent la façon dont un organisme est formé. Parmi ces approches, la manipulation des tissus est un outil clé dans le décryptage des questions complexes sur le destin des cellules, le mouvement cellulaire, et l'organisation des tissus. Une façon de modifier les environnements de tissus locaux se fait par l'application chirurgicale de microbilles qui sont utilisés pour fournir une source focale de protéines ou d'autres molécules de signalisation 1. Ce type de manipulation expérimentale a été largement mis en œuvre dans les modèles d'embryologie vertébrés classiques, comme la grenouille et poussin 2.

Le poisson zèbre est devenu un important organisme modèle vertébré pour l'étude de l'organogenèse et fournit également de nombreux avantages uniques pour la modélisation de la maladie 3-5 car ils partagent la conservation génétique élevée avec les humains 6. En particulier, la transparence optique et exle développement interne de l'embryon de poisson zèbre offre un point de vue incomparable pour l'observation de l'ontogenèse des tissus 3-5. La mise en œuvre de grands écrans génétiques terme a généré un référentiel puissant de souches mutantes de poisson zèbre pour complément d'étude 7,8, et l'identification des techniques de dépistage alternatives qui peuvent être efficacement menée à échelle réduite dans les laboratoires simples 9,10. En outre travail expérimental avec le poisson zèbre a été facilitée par les progrès dans les méthodes transgéniques et inverser approches génétiques 11,12, ainsi que la génétique chimiques 13-15.

techniques de manipulation des tissus, tels que la mise en oeuvre de microbilles, ne sont pas aussi largement utilisée dans le poisson zèbre, mais néanmoins fournir un outil utile pour mieux comprendre la signalisation cellulaire au cours du développement. Microbead implantation a été utilisé pour interroger les processus de formation d'organes dans la rétine de poisson zèbre16,17, 18 coeur, le cerveau 19-22, la crête neurale 23, et la nageoire 24,25. Dans ces études et d'autres, les perles ont été appliquées au cours du développement de comprendre la diffusion de molécules de signalisation 26, comment gradients affectent la migration des cellules 27 et la structuration axiale 28. Plus récemment, les microbilles ont été utilisées pour évaluer les mécanismes de régénération chez les adultes de poisson zèbre 29. Dans les études de développement, par exemple, le travail de microbilles poisson zèbre a donné un aperçu sur les mécanismes de formation des membres à travers des études de la nageoire pectorale 25. Le bourgeon nageoire pectorale poisson zèbre est homologue à l'œuf des membres antérieurs dans le 30 souris et poussin 31. Le bourgeon vertébré membre dispose de deux nœuds de signalisation essentiels: la zone d'activité polarisante (ZPA) qui établit l'axe antéro-postérieur à travers l'expression de Sonic Hedgehog (Shh) et des gènes cibles de Hox aval,et la crête ectodermique apicale (ARE) présente à l'extrémité du bourgeon de membre, qui agit pour établir proximale à l'identité distale du membre à travers l'expression des facteurs de croissance des fibroblastes (FGF). En implantant des microbilles Fgf trempés dans de poisson zèbre mutants génétiques Shh, les enquêteurs FGF identifié comme essentiel à la progression du cycle cellulaire et la croissance de la branche 25 vertébré. En plus de FGF et Shh signalisation cascades qui établissent l'identité de position, des études pionnières en utilisant le bourgeon poussin membre identifié l'acide rétinoïque (RA) comme une molécule qui pourrait imiter l'action de la région de polarisation pour établir l'identité antérieure à postérieure 32. Ces expériences impliqués plaçant de petites bandes de papier Whatman RA-imbibé dans le membre de poussin pour évaluer chiffres structuration 32. En outre, les chercheurs ont effectué d'autres études utilisant des élégantes l'utilisation de microbilles, la transplantation de cellules, et exogèneTraitements de la PR chez le poisson zèbre pour déterminer que RA agit pour fournir à long terme les indices de position dans le cerveau postérieur poisson zèbre et le mésoderme 28. Cependant, à l'heure actuelle de nombreuses questions demeurent sur les rôles des facteurs comme Fgf et RA de signalisation au cours de nombreux aspects du développement des vertébrés. Les effets de signalisation du RA, agissant comme un morphogène, l'impact de nombreux organes 33, comme le cœur de développement 34 et les progéniteurs rénaux, où RA précise des cellules de rein proximales de type destins 35-39. Une meilleure compréhension de ces sujets pourrait bénéficier considérablement des études expérimentales en utilisant des techniques de manipulation des tissus et microbille implantation.

Bien que peu d'études ont été réalisées avec microbille implantation dans le poisson zèbre, par rapport à des modèles comme le poussin, ceux qui ont été menées ont été très instructif. Une des raisons de la rareté des microbilles implantation-recherche basé à l'embryon de poisson zèbre est likely la notion selon laquelle il existe des problèmes techniques difficiles, sur la base de la taille de l'embryon, qui constituent un obstacle à la réalisation avec succès de telles manipulations. Cependant, microbille implantation dans des embryons de poisson zèbre peut être appris avec la pratique et assistée par l'observation visuelle de la technique, et peut donc être poursuivi comme un moyen d'interroger les mécanismes de développement. Ici, nous démontrons l'application précise d'une microbille dans l'embryon de poisson zèbre, qui peut être utilisé pour la réalisation d'une grande variété de tests sur la formation du tissu et de la morphogenèse cellulaire.

Protocol

Les procédures pour travailler avec des embryons de poisson zèbre décrites dans le présent protocole ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle à l'Université de Notre Dame. Préparation de la solution de Ringer 1. Faire une solution de NaCl 116 mM, 2,9 mM de KCl, 3,6 mM CaCl 2, et 5 mM Hepes avec ultrapure H 2 O par agitation continuelle pour éviter toute précipitation de sel. Après addition de sels et tandis que la solution est toujours sous agitation, ajouter 100 unités / ml de pénicilline et par 100 ug de streptomycine par ml. Après l'ajout de tous les antibiotiques et des sels, effectuez filtre stérilisation de la solution et de stocker dans le récipient stérile. Remarque: N-phénylthiourée (1-phényl-2-thiourée) ou PTU peuvent être ajoutés à la solution de Ringer pour bloquer la formation de pigment dans bourrelet embryons implantés sans conséquences négatives pour la santé de l'embryon. Pour préparer la solution de blocage / de la pigmentation de Ringer, utiliser un concentration de 0,003% PTU. En raison de la faible concentration de PTU à ajouter, il est conseillé que le plus grand volume de la solution de Ringer être faite, au moins 1 L, pour éviter d'ajouter de quantités infimes de poudre PTU. Ajouter PTU lors de l'étape 1.2, tandis que la solution est bluffante. 2. Préparation de la solution Tricaine Ajouter 2 g de 3-aminobenzoate méthanesulfonate (Tricaine) par litre de solution plus 0,1 M Tris, à partir d'un 1 M de stock équilibrée à un pH de 9,5 et fait avec ultrapure H 2 O. Remarque: Tricaine sera utilisé pour euthanasier les embryons de poisson zèbre au point de temps désiré pour doser perles phénotypes d'implantation. 3. Préparation de la solution E3 Ajouter une solution de 0,25 M de NaCl, 10 mM de KCl, 12,5 mM de CaCl2, et 16,6 mM de MgSO 4 à 1 L d'eau ultrapure pour créer une L de E3. Ajouter 200 pi de bleu de méthylène à la solution E3 pour inhiber la croissance fongique. 4. Tirer Aiguilles pour le transfert Microbead Utilisez le feu poli verre borosilicate avec filament à une DO: 1,0 mm, ID: 0,5 mm, d'une longueur de 10 cm. Placez le verre borosilicaté dans un extracteur micropipette pour préparer de fines aiguilles. Remarque: Les quatre dimensions suivantes peuvent être utilisées comme un point de départ pour tirer les aiguilles: Chaleur = 540, Pull = 245, Velocity = 200, et de l'heure = 125. Après avoir tiré un nombre suffisant d'aiguilles, magasin en plastique couverte boîtes de Pétri, positionnés sur des bandes de pâte à modeler ou de ruban adhésif pour éviter la rupture de la pointe de l'aiguille, jusqu'à utilisation. Pour couper la pointe de l'aiguille de la taille d'alésage souhaité, utiliser une paire de pinces fines pour marquer la fin de l'aiguille. Remarque: la taille de l'alésage d'aiguille varie en fonction de la taille de la microbille étant utilisé ainsi que les préférences de manipulation de l'utilisateur. Un bon point de départ est de taille artisanale de forage dans une fourchette comprise entre 100 et 200 um si microbilles allant de 50 à 100 um seront utilisés. Prior à utiliser, insérer l'aiguille taillée dans le support de tube capillaire à la mode l'instrument de transfert de microbilles terminée. 5. Moustaches / Lash outil de préparation Obtenir une moustache, fouetter, ou autre petit morceau mais ferme de filament de cheveux naturels ou synthétiques. Coupez près de la base du filament à un angle de 45 °. Respecter la moustache à une pointe de micropipette P-1000 avec de la colle adhésif transparent permanent. 6. Microbead Implantation Plateau Préparation Mélanger 2 g d'agarose dans 100 ml d'une solution E3 pour faire un gel d'agarose à 2% E3. Chauffer la solution d'agarose à 2% pendant 1 min et 30 sec dans une fiole d'Erlenmeyer de 250 ml, en agitant le flacon toutes les 30 secondes pour éviter le gel de bouillonnant. Prenez le couvercle d'une boîte de Pétri de 15 mm x 60 mm et le placer dans une plus grande boîte de 150 mm x 15 mm avec l'intérieur vers le haut. Verser le gel d'agarose chaude dans le 150 mm boîte de Pétri x 15 mm, en veillant à ancrer le basle couvercle de la plus petite assiette avec l'index. Remarque: Prévoir une mince couche d'agarose ci-dessous le couvercle du petit plat pour enlever la condensation qui se forme lorsque la coulée du gel; cela va rendre les perles plus facile à voir sous un microscope de dissection. Comme l'agarose se refroidit, mais avant qu'il se solidifie, placer un moule bien sur le gel. Cela permettra de faciliter le placement des embryons. Remarque: Afin d'éviter les bulles dans les puits, placer le moule lentement à un angle jusqu'à ce qu'il flotte sur le dessus du gel. Utiliser une microspatule, retirez soigneusement le moule de bien une fois le gel a solidifié. Ajouter la solution E3 et conserver à 4 ° C. 7. embryon Collection Préparer des chambres d'accouplement, séparés par des cloisons, en les remplissant avec de l'eau du système, puis en plaçant mâle adulte (s) et le poisson-zèbre (s) paires féminines dans les chambres O / N. Ramassez les œufs fécondés à l'aide d'un grillage à mailles fines crépine (stades embryonnaires varient légèrement). Déposer les oeufs fécondés dans un, de 10 cm de diamètre de Pétri propre en tournant le filtre à l'envers et de rinçage avec un jet fin de l'E3 jusqu'à ce qu'il n'y pas d'œufs laissés dans la passoire, et il y environ 25 ml de solution E3 dans le plat. Après la collecte, diviser les œufs dans plusieurs plats (environ 50-60 œufs par boîte) pour éviter la surpopulation, qui pourrait conduire à l'asynchronisme du développement au sein de l'embrayage et de faire la collecte fois les points souhaités difficile. Incuber embryons en solution E3 à 28,5 ° C pour permettre l'évaluation du développement conformément à la série de la mise en scène de poisson zèbre standard de 40. Remarque: Les embryons devraient être transférés à l'E3 / PTU à 24 h après la fécondation (HPF) pour empêcher le développement de pigment si manipulations à des stades plus âgés nécessitent clarté optique. 8. Perle Implantation Incuber les microbilles de la concentration en molécule à tester ou le véhicule souhaité correspondant solution pendant le temps nécessaire dans un volume approprié. Remarque: Le chercheur peut utiliser des boîtes de Pétri stériles allant de 3-6 cm de diamètre, ou des plaques multi-puits, les deux qui permettent la visualisation des microbilles au sein de la solution. Le temps peut varier selon le type et la quantité de molécule d'intérêt, et le chercheur doit se référer aux recommandations publiées fabricant ou pour une durée d'incubation et d'autres aspects tels que la sensibilité à la lumière et la température. Une fois les embryons ont atteint le point de temps de développement souhaité, retirez les embryons de leurs chorions aide de pinces fines. Incuber les embryons dans une solution de Ringer filtrée avec des antibiotiques pendant 10 minutes pour les acclimater à la solution. Alors que les embryons sont Acclimatation, transférer les microbilles dans la plaque de microbilles niché dans le bac d'implantation et rincez-les dans une solution de Ringer pour 10 min. Remarque: Implanter les perles à moins de 50 min après avoir atteint ce point. Ce wmalade diminuer la probabilité que l'on va implanter un bourrelet avec une plus petite concentration de la molécule d'intérêt. Tableau des embryons dans les puits du plateau microbille d'implantation, en prenant soin de les orienter de sorte que la zone d'intérêt où la microbille sera implanté est accessible. Faire une petite incision sur l'embryon en utilisant l'aiguille de tungstène. Transférer une microbille sur l'embryon aide de la pipette de transfert microcapillaire: appuyant l'ampoule de la pipette, tirez doucement sur la microbille dans la colonne capillaire, puis relâchez la pression pour transférer la microbille à la destination souhaitée. Utilisez l'outil moustaches / fouet à positionner la microbille l'intérieur de l'embryon. Remarque: Veillez à positionner la microbille dans le tissu loin du site d'incision de sorte que la microbille ne sera pas expulsé de l'embryon comme il guérit.

Representative Results

Plusieurs types d'outils de manipulation sont utiles pour le traitement des microbilles pendant les applications de recherche (Figure 1). En outre, un moule agarose simple avec petits puits peut être utilisé pour maintenir l'embryon de poisson zèbre, ce qui est essentiel pour effectuer ces expériences dans une manière opportune et efficace (Figure 1). L'implantation d'une microbille peut être effectuée à la position spatiale et temporelle stade d'intérêt, ce qui permet aux chercheurs de se rétrécissent une fenêtre d'action spécifique pour la molécule d'intérêt. Ici, les microbilles simples ont été implantés dans des embryons de poisson zèbre au stade queue de bourgeon ou à des points de temps plus tard, pendant les phases de somitogenèse (Figure 3). Deux microbilles de tailles différentes, rincés avec la solution de Ringer seul, ont été utilisés dans ce protocole de démonstration (figure 3A, 3B et 3C). Cette implantation de microbilles en l'absence de tout conjuguépetites molécules démontre que les perles implantation peut être réalisée sans effets morphologiques bruts pendant le bon développement de l'embryon de poisson zèbre (figure 4). L'expérimentateur peut rencontrer des difficultés à la manoeuvre de la microbille dans le trou de la ponction faite par une aiguille de tungstène au sommet de l'embryon. Pour parvenir à une meilleure gestion de la microbille une fois posé sur l'embryon par la micro-aiguille, un cheveu / outil cils peut être utilisé. Cela peut être conçu avec naturellement hangar féline ou canine moustaches, bien que d'autres filaments de cils naturels ou synthétiques peuvent être utilisés (Figure 1). Une légère poussée de la microbille soit avec l'aiguille de tungstène ou l'outil de moustache devrait voir la microbille sombrer dans la solution de Ringer du moule. Une fois que la microbille a coulé dans le moule, il doit être déplacé de grandes distances si nécessaire en utilisant l'aiguille de tungstène et une fois au sommet de l'embryon de l'outil d'aiguille ou whiskers peut être utilisé pour position la microbille dans l'embryon. Le succès de l'implantation de microbilles peut être mesuré grâce à la visualisation immédiatement à un stéréomicroscope, selon le bourrelet reste positionné de manière stable dans le tissu. Afin d'évaluer la position des billes dans le temps, chaque échantillon d'embryon peut être imagée par le biais direct décours temporel photographie ou vérifié à des intervalles périodiques (comme représenté sur la figure 4) pour faire en sorte que l'emplacement de la bille n'a pas changé au cours de la durée de l'expérience à cause de tissu endogène morphogenèse. Comprendre la position de la bille au fil du temps est essentielle pour l'interprétation la plus informés des résultats, comme l'évaluation de l'effet d'une petite molécule sur un tissu cible ou processus de développement. L'utilisation de ces étapes ci-dessus fournira un environnement idéal pour incruster des microbilles dans l'embryon de poisson zèbre à une heure et la position souhaitée. Dans notre expérience, les utilisateurs novices de ce protocole microbille d'implantation généralement gagné le nec de compétencesnéces- pour effectuer l'implantation chirurgicale cohérente de microbilles dans l'embryon de poisson zèbre après environ une semaine de pratique. Figure 1. Outils utilisés pour effectuer des microbilles implantation. (A) Le plateau d'implantation de talon (gauche, 15 cm de diamètre) avec des moules de l'embryon (à gauche) et un plateau microbille d'incubation (à droite, 6 cm de diamètre). Ce plateau de travail permet au chercheur de placer les embryons dans l'orientation désirée pour microbille implantation, et d'avoir des microbilles préparées pour une implantation à proximité immédiate de la station de microscope. Les microbilles doivent être incubées à petite molécule (s) et / ou le véhicule, puis rincées dans une plaque séparée de microbilles (à droite) avant de les placer dans le bac d'implantation de talon qui est positionné sous la station de microscope. (B) Deux paires de pinces fines seront utilisés pour enlever la chorisur entourant chaque embryon de poisson zèbre et aussi à rompre l'extrémité de l'aiguille de micro-capillaire. (C) Une aiguille de tungstène sera employée pour faire une très fine ponction dans l'embryon de poisson zèbre dans lequel de positionner la microbille. (D) La pipette de transfert microcapillaire sera utilisé pour ramasser et positionner une microbille sur le dessus de l'embryon de poisson zèbre à proximité du site de la ponction. (E) La moustache / outil cils va permettre le positionnement en douceur de la microbille dans le site de l'incision au sein de l'embryon qui a été précédemment faite par l'aiguille de tungstène. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2. Représentation schématique de la procédure d'implantation microbille. (A) Un bac d'implantation de microbilles avec des microbilles soaking dans la solution de lavage désiré est mis en place en vertu d'une station de stéréoscopique, et les embryons positionné avec le tissu vers le haut. (B) En utilisant une aiguille de tungstène, une petite incision dans l'embryon peut être faite avec un léger mouvement énergique encore. (C) en utilisant une pipette de transfert microcapillaire, la microbille souhaitée peut être ramassé de la chambre microbille d'incubation dans le bac, situé sur la droite, et amené au compartiment gauche, où la zone de travail de l'embryon est situé. La microbille doit être déposé à proximité du site de l'incision, alors positionné doucement dans le site de l'incision faite par l'aiguille de tungstène en utilisant la moustache / outil cils. Une fois une microbille est manoeuvré dans le site de l'incision, il doit être rentré dans le tissu (loin de l'incision) pour positionner de manière stable la microbille et prévenir le déplacement ultérieur de l'embryon que le développement continue. Plouer cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3. microbilles peuvent être implantés dans des embryons à différents stades de développement. (A) embryons de poisson zèbre ont été implantés avec une microbille (diamètre d'environ 50 um) dans le coffre au stade queue de bourgeon. Lorsque examiné à l'implant poste de talon de 24 heures (de hpbi), les embryons avaient développé normalement et la microbille a montré un minimum de mouvement lors du passage du temps de développement. (B) embryons de poisson zèbre implantés avec des microbilles (avec un diamètre d'environ 50 um) dans le sac jaune au stade 3 de somites (ss) affichés développement normal avec le mouvement du talon relativement mineur au fil du temps. (C) plus grands microbilles (diamètre d'environ 70 um) ont été implantés dans l'embryon 7 ss similaire a montré le développement ultérieur normal, ainsi que des mini-mal si un mouvement à partir du site d'implantation. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4. développement bruts de l'embryon de poisson zèbre est perturbé par la présence d'une microbille à 72 hpbi. Embryons de poisson zèbre ont été implantés avec des microbilles trempés dans une solution de Ringer (avec un diamètre d'environ 50 um) au stade 7 somites (ss). Chaque microbille a été chirurgicalement inséré dans le coffre, entre les somites 3 ​​et 4. La présence de la perle n'a pas été associée à des défauts manifestes de développement au implant poste de talon de 24 heures (de hpbi), 48 hpbi, ou 72 hpbi. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

Discussion

Au cours du siècle passé, la compréhension du plan de corps structuration et l'organogenèse a subi des avances monumentales. techniques de manipulation de tissus étaient critiques dans la découverte des informations clés sur ces processus vitaux. La modification génétique est l'une des méthodes les plus couramment utilisées pour déterminer la fonction des gènes et des méthodes d'analyse de la mosaïque, tels que la transplantation de cellules, de fournir des approches utiles pour comprendre l'autonomie de la fonction des gènes. Implantation Microbead fournit un autre lieu d'interroger comment les molécules notamment de modifier la dynamique de développement, car cette méthode permet au chercheur de modifier un environnement tissulaire locale en introduisant des molécules ou des inhibiteurs de la signalisation. Une gamme de microbilles différentes sont disponibles dans le commerce, qui ont différentes tailles et d'autres propriétés physiques exister (par exemple, la charge) de telle sorte qu'ils peuvent être utilisés pour les conditions expérimentales d'intérêt. Ainsi, en implantant des microbilles qui sont trempés dans une protéine ou chimicocal d'intérêt au sein d'un organisme, les chercheurs peuvent étudier les effets localisés au cours du développement et de trouver des associations entre le gène ou d'une molécule d'intérêt et notamment phénotype (s) biologique.

Des études comme celle effectuée par Wada et ses collègues utilisé microbille implantation afin d'évaluer l'effet de l'augmentation de signalisation Hedgehog dans la structuration du squelette dans la boîte crânienne antérieure (ANC) chez le poisson zèbre 23. Des études antérieures ont montré que Shh est nécessaire pour la formation 14 de l'ANC. Utilisant des microbilles Shh revêtus chercheurs ont identifié que ce signal favorise la formation du cartilage dans l'ANC. Le processus d'implantation de microbille a été utilisé pour démontrer un lien clair entre signalisation Hedgehog et la formation de cartilage dans l'ANC. Un autre exemple clé de cette technique de manipulation des tissus chez le poisson zèbre est observé dans les études où les scientifiques ont étudié le contrôle transcriptionnel du Erythroblastoma vingt-six (ETS) domaine fmolécule apparentée-ETS des acteurs (Erm) et polyome activateur 3 (Pea3) par la signalisation FGF au début le développement du cerveau du poisson zèbre 19. Grâce à des expériences d'implantation de microbilles, ils ont pu montrer que Fgf8 et FGF3 peuvent activer l'expression ectopique de erm et PEA3. Ces exemples illustrent l'utilité de microbilles à fournir des indications sur les mécanismes de développement qui collaborent lors de la formation des tissus, ce qui peut être bien caractérisé par l'utilisation de méthodes d'évaluation de l'expression du gène 41. Ainsi, microbille transplantation peut être une méthode viable pour explorer d'autres tissus, tels que le mésoderme intermédiaire (IM) qui donne naissance à du rein. Plus précisément, il aider dans les études de développement rénales, pour étudier comment différentes molécules affecte néphrons segmentation 42 et tubulogenèse 43,44, processus qui ne sont que superficiellement compris à l'heure actuelle. En outre, microbille implantation a commencé à être utilisé au harasprocessus y de régénération chez le poisson zèbre 29] et pourraient être adaptés pour une utilisation avec n'importe quel nombre de modèles de régénération d'organes, tels que l'ablation laser suivante de tissus embryonnaires comme le néphron 45 ou en conjonction avec des méthodes qui ont été formulés pour effectuer des recherches avec les structures adultes correspondants 46-49. Enfin, l'implantation microbille a le potentiel pour être utilisé dans des modèles de maladies humaines telles que le cancer ou le tissu 50,51 52,53 dégénérescence.

Dans le présent protocole, nous démontrons la méthode de microbille implantation dans embryons de poisson zèbre, qui a également été décrit de façon similaire par d'autres chercheurs, mais non représentée par des protocoles de vidéo 1. Avec la pratique minimale, nous avons pu implanter microbilles à un taux approximatif de 8-10 embryons / h, ce qui concerne la faisabilité de cette procédure une fois le chercheur a une certaine expérience. Les résultats présentés ici démontrent que les perles de différentes dimensions peuvent être implantés à un stade précoce, et ce avec précaution, cette technique de manipulation des tissus peuvent être mises en oeuvre avec un minimum de perturbation physique de l'embryon. Une amélioration qui mérite d'être souligné est l'utilisation d'un outil moustaches / fouet à positionner la microbille dans l'embryon. Cette pièce relativement peu coûteux et simple de l'équipement est d'environ le même diamètre que la microbille, est facile à obtenir et permet d'accélérer le processus d'implantation. La moustache / cils peut être coupée à la longueur désirée pour produire une entreprise encore outil de perles manipulation délicate, selon le chercheur de dextérité et de préférence. Enfin, alors que nous avons décrit ici comment manipuler physiquement microbilles et d'embryons de poisson zèbre pour effectuer d'implantation, ce protocole ne précise pas les procédures de manutention spécifiques pour différents médicaments ou peptides. En général, les microbilles traitées chimiquement devraient être implantés dans l'animal avec l'opportunisme, pour éviter les effets indésirables dans d'autres régions de l'organisme, et les chercheurs devraient être bien enformé sur les préoccupations de sécurité possibles associés à de tels produits chimiques avant d'entreprendre leurs études.

En somme, nous avons démontré une méthode relativement simple et efficace microbille implantation avec une large gamme d'applications utilisant des matériaux qui sont facilement disponibles dans le laboratoire. En fin de compte, nous espérons que ce manuel aidera les chercheurs à la nature délicate de la manipulation des tissus de poisson zèbre.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le NIH subvention DP2OD008470.

Materials

Sodium Chloride American Bioanalytical AB01915
Potassium Chloride American Bioanalytical AB01652
Calcium Chloride American Bioanalytical AB00366
HEPES Sigma Life Science H4034
Penicillin-Streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333-20ML
N-Phenylthiourea (PTU) Aldrich Chemistry P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricane) Fluka Analytical A5040
Borosilicate glass Sutter Instruments Co. BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Mo. P097
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140
250mL Erlenmeyer Flask Fischer Scientific FB-500-250
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile Corning 430167
60mm x 15mm VWR 25373-085
100mm x 15mm VWR 25373-100
150mm x 15mm VWR 25373-187
Saint-Gobain Chemware Microspatula Fischer Scientific 21-401-50B
P-1000 Micropipette tips Fischer Scientific 2707402
Low Temperature Incubator Fischer Scientific 11 690 516DQ
Dimethly Sulfoxide American Bioanalytical AB00435
Microbeads (45-106 µm) Biorad 140-1454 AG1-X8
Microbeads (45 µm) Polysciences 7314
Micro Dissecting Tweezer Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010
Tungsten Needle Roboz Surgical Instruments Co. RS-6065
Capillary tube holder Globe Scientific Inc.  51674
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References

  1. Picker, A., et al., Lieschke, G. J., et al. Tissue micromanipulation in zebrafish embryos. Zebrafish, Methods in Molecular Biology. 546, (2009).
  2. Wilson, J., Tucker, A. S. Fgf and Bmp signals repress the expression of Bapx1 in the mandibular mesenchyme and control the position of the developing jaw joint. Dev Biol. 266, 138-150 (2004).
  3. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  4. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  5. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  6. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  7. Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
  8. Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22, 473-478 (2006).
  9. Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl Res. 163, 65-78 (2014).
  10. Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. J Vis Exp. 89, e51708 (2014).
  11. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
  12. Auer, T. O., Del Bene, F. CRISPR/Cas9 and TALEN-mediated knock-in approaches in zebrafish. Methods. 69, 142-150 (2014).
  13. Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 12965-12969 (2000).
  14. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res C Embryo Today. 93, e52063 (2011).
  15. Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high–throughput using zebrafish embryos. J Vis Exp. , 52063 (2014).
  16. Hyatt, G. A., Schmitt, E. A., Marsh-Armstrong, N., McCaffery, P., Dräger, U. C., Dowling, J. E. Retinoic acid establishes ventral retinal characteristics. Development. 122, 195-204 (1996).
  17. Picker, A., Brand, M. Fgf signals from a novel signaling center determine axial patterning of the prospective neural retina. Development. 132, 4951-4962 (2005).
  18. Reifers, F., Walsh, E. C., Leger, S., Stainier, D. Y. R., Brand, M. Induction and differentiation of the zebrafish heart requires fibroblast growth factor 8 (fgf8/acerebellar.). Development. 127, 225-235 (2000).
  19. Raible, F., Brand, M. Tight transcriptional control of the ETS domain factors Erm and Pea3 by Fgf signaling during early zebrafish development. Mech Dev. 107, 105-117 (2001).
  20. Reim, G., Brand, M. spiel-ohne-grenzen/pou2. mediates regional competence to respond to Fgf8 during zebrafish early neural development. Development. 129, 917-933 (2002).
  21. Jaszai, J., Reifers, F., Picker, A., Langenberg, T., Brand, M. Isthmus-to-midbrain transformation in the absence of midbrain-hindbrain organizer activity. Development. 130, 6611-6623 (2003).
  22. Hirati, Y., Okamoto, H. Canopy1, a novel regulator of FGF signaling around the midbrain-hindbrain boundary in zebrafish. Curr Biol. 16, 421-427 (2006).
  23. Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
  24. Abe, G., Ide, H., Tamura, K. Function of FGF signaling in the developmental process of the median fin fold in zebrafish. Dev Biol. 304, 355-366 (2007).
  25. Prykhozhij, S. V., Neumann, C. J. Distinct roles of Shh and Fgf signaling in regulating cell proliferation during zebrafish pectoral fin development. BMC Dev Biol. 8, 91 (2008).
  26. Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis controls spreading and effective signaling range of Fgf8 protein. Curr Biol. 14, 1834-1841 (2014).
  27. Hardt, S., et al. The Bmp gradient of the zebrafish gastrula guides migrating lateral cells by regulating cell-cell adhesion. Curr Biol. 17, 475-487 (2007).
  28. White, R. J., Nie, Q., Lander, A. D., Schilling, T. F. Complex regulation of cyp26a1 .creates a robust retinoic acid gradient in the zebrafish embryo. PLoS Biol. 5, e2522-e2523 (2007).
  29. Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
  30. Niswander, L., Jeffrey, S., Martin, G. R., Tickle, C. A positive feedback loop coordinates growth and patterning in the vertebrate limb. Nature. 371, 609-612 (1994).
  31. Laufer, E., Nelson, C. E., Johnson, R. L., Morgan, B. A., Tabin, C. Sonic hedgehog and Fgf-4 act through a signaling cascade and feedback loop to integrate growth and patterning of the developing limb bud. Cell. 79, 993-1003 (1994).
  32. Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. Local application of retinoic acid to the limb bud mimics the action of the polarizing region. Nature. 296, 564-566 (1982).
  33. Samarut, E., Fraher, D., Laudet, V., Gibert, Y. ZebRA: an overview of retinoic acid signaling during zebrafish development. Biochimica et Biophysica Acta. 1849, 73-83 (2015).
  34. Lengerke, C., et al. Interactions between Cdx genes and retinoic acid modulate early cardiogenesis. Dev Biol. 354, 134-142 (2011).
  35. Wingert, R. A., et al. The cdx and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  36. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  37. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  38. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom., and Notch signaling. Dev Biol. 386, 111-122 (2014).
  39. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a. transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev Biol. 399, 100-116 (2015).
  40. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  41. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J Vis Exp. , e51604 (2014).
  42. Cheng, C. N., Wingert, R. A., Carver, E., Lessman, C. Chapter 9: Renal system development in the zebrafish: a basic nephrogenesis model. Zebrafish: Topics in Reproduction & Development. , (2014).
  43. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota .and zeta. Dev Biol. 396, 183-200 (1016).
  44. McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr Patterns. 16, 104-113 (2014).
  45. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. , e2845 (2011).
  46. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  47. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. 54, e2839 (2011).
  48. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. , e51644 (2014).
  49. McCampbell, K. K., Springer, K., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cells Int. In press, (2015).
  50. Lee, S. L., et al. Hypoxia-induced pathological angiogenesis mediates tumor cell dissemination, invasion, and metastasis in a zebrafish tumor model. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19485-19490 (2009).
  51. Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Prot. 5, 1911-1918 (2010).
  52. Cao, R., Jensen, L. D. E., Söll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3, e2748 (1371).
  53. Cao, Z., et al. Hypoxia-induced retinopathy model in adult zebrafish. Nat Prot. 5, 1903-1910 (2010).

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Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (101), e52943, doi:10.3791/52943 (2015).
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