Questo protocollo descrive l'isolamento delle cellule satelliti da muscoli della testa branchiomeric di un ratto 9 settimane di età. I muscoli provengono da diversi archi branchiali. Successivamente, le cellule satelliti sono coltivate su un rivestimento macchia di dimensioni millimetriche per studiare la loro differenziazione. Questo approccio evita l'espansione e passaging di cellule satelliti.
Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.
Circa 1: 500-1: 1000 neonati presentano una fenditura che coinvolge il labbro e / o palato (CLP); Così questo è la malformazione congenita più comune negli esseri umani 1. I muscoli del palato molle sono fondamentali per il funzionamento del palato molle durante il discorso, deglutizione e succhiare. Se una fessura del palato molle è presente, questi muscoli sono anormalmente inseriti nell'estremità posteriore dell'osso palatale.
Il palato molle si muove su e giù durante il discorso, impedendo che l'aria di fuggire attraverso il naso. I bambini con una fenditura nel palato non hanno questa funzione di controllo con conseguente fenomeno noto come velopharyngeal disfunzione 2,3. Anche se i protocolli di trattamento sono variabili, la riparazione chirurgica del palato molle si svolge nella prima infanzia (6-36 mesi di età) 4. I muscoli anormalmente inseriti del palato molle possono essere corretti chirurgicamente 5-7, tuttavia, disfunzione velopharyngeal persiste nel 7% al 30%dei pazienti 2,3,8-10.
La capacità del muscolo scheletrico di rigenerare attraverso l'azione di cellule satelliti (SCS) è ben consolidata 11,12. Su infortunio muscolare, SC sono attivati e migrano al sito di lesione. Poi proliferano, si differenziano e si fondono per formare nuove fibre muscolari o riparare danneggiati quelle 13. Quiescenti CS esprimono il fattore di trascrizione Pax7 14,15, mentre la loro progenie, i mioblasti proliferanti, inoltre esprimere il fattore miogenico determinazione 1 (MyoD) 16. Mioblasti differenziazione iniziano a esprimere miogenina (MyoG) 17. La differenziazione terminale dei mioblasti è caratterizzato dalla formazione di miofibre, e l'espressione di proteine muscolo-specifici come catena pesante della miosina (MyHC) 16,18.
Recentemente, diverse strategie sono state utilizzate nella medicina rigenerativa per migliorare la rigenerazione muscolare dei muscoli degli arti 19-23. Studi specifici sumuscoli della testa branchiomeric sono importanti anche perché è stato recentemente dimostrato che si differenziano da altri muscoli in diversi aspetti 24. In contrasto con i muscoli degli arti, è stato suggerito che i muscoli della testa branchiomeric contengono meno SC 25, rigenerano più lento, e il tessuto connettivo fibroso più si forma dopo l'infortunio 26 Inoltre, proliferando SC da muscoli della testa branchiomeric esprimere anche altri fattori di trascrizione. Ad esempio, Tcf21, un fattore di trascrizione per la formazione del muscolo craniofacciale è fortemente espresso in rigenerare muscoli della testa, ma difficilmente a rigenerare i muscoli degli arti 25. I muscoli del palato molle dei pazienti CLP sono solitamente più piccoli e meno ben organizzata rispetto ai normali muscoli palatini 27,28. Fibre lente e veloci sono entrambi presenti nei muscoli del palato molle ma le fibre lente sono più abbondanti. Al contrario, i muscoli leporino contengono una percentuale di fibra veloci e anche una fornitura capillare ridottarispetto ai normali muscoli del palato molle 29-31. Le fibre veloci sono maggiormente soggetti a danni contrazione indotta 31-33. Il povero fornitura capillare di accompagnamento può anche favorire la fibrosi 34,35. Tutti questi aspetti possono contribuire alla scarsa rigenerazione dei muscoli del palato molle dopo la chiusura chirurgica schisi 36. In considerazione di ciò, un protocollo per l'isolamento e la caratterizzazione di muscolo testa branchiomeric SC è cruciale. Questo offre la possibilità di studiare la biologia SC dei muscoli della testa branchiomeric. Inoltre, le nuove terapie a base di ingegneria dei tessuti possono essere sviluppate per promuovere la rigenerazione muscolare dopo l'intervento chirurgico in CLP e le altre condizioni che compromettono la zona cranio-facciale.
In generale, SC possono essere ottenuti dopo la dissociazione del tessuto muscolare 14. Tritare, digestione enzimatica, e triturazione sono generalmente tenuti a rilasciare SC dalla loro nicchia. SC può essere purificato mediante pre-placcatura su piatti non rivestite 14,37,38, fractionation su Percoll 39,40, cellulare o fluorescente-o magnetico di ordinamento 41-43. Qui vi presentiamo un nuovo protocollo economica e rapida per l'isolamento delle cellule satelliti da muscoli della testa branchiomeric di giovani ratti adulti. Questo protocollo è basato su una precedente manoscritto 14 e specificamente idonei per piccoli campioni di tessuto. L'isolamento di SC da muscoli rappresentativi provenienti dal 1 °, 2 °, e 4 ° archi branchiali sono descritti. Dopo l'isolamento, un basso numero di cellule satelliti sono coltivate su extracellulari macchie gel matrice di dimensioni millimetriche per studiare la loro differenziazione. Questo approccio consente di evitare l'obbligo per l'espansione e passaging di SC.
SC da diversi muscoli della testa branchiomeric sono stati isolati da una 9 settimane di età ratto Wistar e coltivate direttamente sulla matrice extracellulare spot gel senza previa espansione e passaging. Dopo l'isolamento, le cellule sono state contate e seminate alla stessa densità cellulare. Per l'isolamento parallelo di tre diversi muscoli, questo metodo richiede circa 4 ore. Per evitare la contaminazione cultura, un passaggio critico è il rapido lavaggio in alcool 70% dopo la dissezione dei muscoli.
Durante isolamento SC è importante tagliare il tessuto muscolare in piccoli pezzi (circa 2 mm), ma evitare troppa macinazione come questo si tradurrà in una piccola quantità di cellule a causa di danno cellulare. Inoltre, la durata della digestione enzimatica deve essere controllata attentamente al microscopio per evitare ulteriori danni. Lo scopo della digestione è dissociare le miofibre. Poiché più del 90% delle cellule isolate esprimono Pax7, senza ulteriore purificazione è necessaria (figure 6-8).Questo evita fasi di purificazione supplementare altri metodi come la pre-placcatura sui piatti non patinati 14,37,38, frazionamento su Percoll 39,40, cellulare o fluorescente-o magnetico di ordinamento 41,43. Per triturazione è essenziale per indurre taglio tra i frammenti di tessuto e l'apertura della punta della pipetta come questo permette lo sblocco meccanico del SC. Se la triturazione con una pipetta 10 ml (all'interno Punta di diametro 1 mm) è difficile, a 5 ml (all'interno punta Diametro: 2 mm) pipetta possono essere utilizzati prima. In alternativa, pipette Pasteur di vetro possono essere tagliate a diametro desiderato e possono essere usate. Questo metodo è semplice, efficace e consente l'isolamento simultaneo di SC da campioni di muscolo differenti.
Le piastre di coltura per SCs possono essere rivestiti con gelatina o collagene, ma i nostri studi precedenti mostrano che gel matrice extracellulare è molto meglio per il mantenimento del potenziale miogenico di collagene 38. Le macchie di gel matrice extracellularedimensioni millimetriche (10 microlitri / Ø 2 mm o 20 microlitri / Ø 4 mm) consente lo studio della proliferazione e differenziazione delle CS con un numero limitato di cellule. Per il saggio differenziazione circa 8 a 20 volte meno cellule sono obbligatori confrontati ad una piastra da 24 pozzetti (Ø 15,6 millimetri), e circa 80 a 200 volte meno rispetto a 35 mm di piastre Petri (Ø 35 mm) 14,38.
Dal momento che il gel matrice extracellulare è costoso, questo metodo è anche più conveniente. Inoltre, i vetrini camera possono essere sostituiti da copertura di plastica scivola per ridurre ulteriormente i costi. Per la preparazione del gel matrice extracellulare visto essiccazione overnight delle slitte camera è essenziale. Poiché i punti di gel matrice extracellulare sono trasparenti, è necessario segnare i punti sul lato inferiore con illuminazione posteriore. Le Camere vetrini vengono fissati in una capsula di Petri per una facile manipolazione. Ulteriore espansione coltura cellulare non è necessario, che offre la possibilità di studiare il SC di goccioliler muscoli o campioni di muscolo di piccole dimensioni. In alternativa, ad esempio per la PCR o muscolo costruisce se sono necessari più celle, le SCs appena isolate possono prima essere ampliato in fiasche T75 come indicato sopra.
SC isolato utilizzando questo protocollo non sono suscettibili di depurazione mediante citometria a flusso subito dopo l'isolamento. La digestione con pronasi provoca una digestione notevole della superficie antigeni 14. Siero di cavallo e siero fetale bovino che vengono utilizzati per la coltura delle cellule devono prima essere adeguatamente caratterizzati prima di isolamento, come diversi numeri di lotto interessati differenziale mioblasti proliferazione e differenziazione.
Negli ultimi anni, vi è un crescente interesse nei muscoli derivanti dagli archi branchiali e mesoderma testa (ad esempio, i muscoli estrinseci) 24. È stato chiaramente dimostrato che i muscoli della testa e degli arti possiedono proprietà altamente differenti. Muscolo masticatore da vecchi animali sembra ritain loro capacità rigenerativa in confronto con i muscoli degli arti 25,26. SC dai muscoli estrinseci in possesso di una solida capacità di proliferazione e differenziazione paragonabili a SC da muscoli della testa, e mostrano un potenziale attecchimento più grande di arto muscolare SC 24.
La composizione di distribuzione e miosina tipo di fibra varia tra i gruppi muscolari e anche tra le specie. Muscoli provenienti dal primo arco branchiale nell'uomo contengono fibre sia lente e veloci (sottotipi IIA e IIX), miosine neonatali e myosins tipici per lo sviluppo del muscolo cardiaco. Nei roditori questi muscoli contengono circa il 95% fibre veloci miosina IIA e IIB) 44-46. Gli studi sui muscoli aviaria mostrano che SC di tipi di fibre muscolari differenti variano nella capacità di differenziazione. SC da fibre veloci differenziano solo in fibre muscolari veloci, mentre SC da fibre lente possono differenziarsi in entrambi i tipi di fibra 47. Inoltre, la percentuale di SC nel muscolo velocefibre è inferiore a quello delle fibre muscolari lente 48,49. Ciò indica che la distribuzione tipo fibra deve essere preso in considerazione per studi sui muscoli nella zona craniofacciale. Simile ai muscoli palatoschisi, la LVP nei roditori contiene quasi esclusivamente fibre veloci 50. Per questo motivo, SC del LVP sono adatti per gli studi pre-clinici nel campo della palatoschisi.
Questo protocollo offre nuove possibilità per studiare SCs derivate dai muscoli della testa branchiomeric o altri piccoli muscoli o muscoli campioni più piccoli. Ciò faciliterà lo sviluppo di nuove terapie per migliorare la rigenerazione dei muscoli nella zona maxillofacciale in condizioni come palatoschisi ma anche in altre condizioni che interessano muscoli più piccoli.
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by a Mosaic grant (017.009.009) from The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) and a Start grant (S-13-167C) for young investigators from the AO Foundation. Z.Y.R is supported by the National Institutes of Health (grant # AG021566, AG035377, NS090051).
Hypodermic Needle 25G 0,5x25m | BD Microlance | 300400 | |
Dissecting scissors | Braun | BC154R | |
Micro forceps straight | Braun | BD330R | |
Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton | 0205 | |
Alcohol 70% | Denteck | 2,010,005 | |
Permanox Slide, 8 Chamber | Thermo Scientific | 177445 | |
6 well cell culture plate | Greiner bio-one | 657160 | |
Cell Culture Dishes (100 x 20 mm) | Greiner bio-one | 664160 | |
15 ml sterile conical centrifuge tube | BD Biosciences | 352097 | |
50 ml sterile conical centrifuge tube | BD Biosciences | 352098 | |
Cell strainer (40 μm) | Gibco | 431750 | |
10 mL serological pipette | Greiner bio-one | 607180 | |
20µL FT20 | Greiner bio-one | 774288 | |
Matrigel, Phenol-Red Free | BD Biosciences | 356237 | 10 mL |
Pronase | Calbiochem | 53702 | 10KU |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569-010 | 500 mL |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 3600511 | 500 mL |
Horse Serum | Gibco | 26050088 | 500 mL |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
Chicken Embryo Extract | MP Biomedicals | 2850145 | 20 mL |