Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.
Vattenmiljön patogen, Streptococcus iniae, ansvarar för över 100 miljoner dollar i årliga förluster för vattenbruksnäringen och kan orsaka systemisk sjukdom i både fiskar och människor. En bättre förståelse av S. iniae sjukdom patogenes kräver ett lämpligt modellsystem. Den genetiska spårbarhet och optisk transparens av de tidiga utvecklingsstadier zebrafisk möjliggör generering och icke-invasiv avbildning av transgena linjer med fluorescerande taggade immunceller. Den adaptiva immunsystemet inte är fullt fungerande förrän flera veckor efter befruktning, men zebrafisk larver har en bevarad ryggradsdjur medfödda immunsystemet med både neutrofiler och makrofager. Således generering av en larvinfektionsmodell möjliggör studier av specifika bidrag medfödd immunitet i att kontrollera S. iniae infektion.
Platsen för mikroinjektion kommer att avgöra om en infektion ärsystemisk eller initialt lokaliserade. Här presenterar vi våra protokoll för öron vesikler injektion av zebrafisk åldern 2-3 dagar efter befruktning liksom våra tekniker för fluorescerande konfokal avbildning av infektion. En lokal infektion webbplats tillåter observation av initial mikrob invasion, rekrytering av värdceller och spridning av infektioner. Våra iakttagelser med hjälp av zebrafisk larver modell av S. iniae infektion indikerar att zebrafisk kan användas för att undersöka de olika bidragen från värd neutrofiler och makrofager i lokaliserade bakterieinfektioner. Dessutom beskriver vi hur photolabeling av immunceller kan användas för att spåra enskilda värdcell öde under infektionsförloppet.
Streptococcus iniae är en stor vattenlevande patogen som kan orsaka systemisk sjukdom i både fisk och människa en. Medan S. iniae ansvarar för stora förluster i fiskodlingsindustrin, är det också en potentiell zoonotisk patogen, kan orsaka sjukdom hos immunsupprimerade mänskliga värdar med kliniska patologier som liknar dem som orsakas av andra streptokock humana patogener. Med tanke på dess likheter med mänskliga patogener, är det viktigt att studera S. iniae sjukdom patogenes i samband med en naturlig värd. En vuxen zebrafisk modell av S. iniae infektion avslöjade robust infiltration av värd leukocyter till lokala infektionsstället samt en snabb tid som värd döden, till en tid för kort involverar det adaptiva immunsystemet 7. För att få en fördjupad undersöka det medfödda immunsvaret mot S. iniae infektion in vivo, är det nödvändigt att använda en modell som är mer mottaglig för non-invasiv levande avbildning.
Larver zebrafisk har ett antal fördelar som gör det till en alltmer attraktivt ryggradsdjur modell för att studera värd patogen interaktioner. Zebrafisk är relativt billiga och enkla att använda och underhålla jämfört med däggdjursmodeller. Adaptiv immunitet är inte funktionellt mogna förrän 4-6 veckor efter befruktningen, men larver har en mycket konserverad ryggradsdjur medfödda immunförsvaret med komplement, Toll-liknande receptorer, cytokiner och neutrofiler och makrofager med antimikrobiella kapacitet inklusive fagocytos och andnings burst 2-6, 8-11. Dessutom genetiska spårbarhet och optisk transparens av de embryonala och larvutvecklingsstadier möjliggör generering av stabila transgena linjer med fluorescerande immunceller som gör det möjligt att undersöka värd-patogen interaktioner i realtid in vivo. Genereringen av dessa transgena linjer med ett photoconvertible protein som Dendra2 möjliggör spårning av enskilda värdcell ursprung och öde under loppet av infektionen 12.
När man utvecklar en zebrafisk larver infektionsmodell, kommer den valda platsen för mikroinjektion avgöra om en infektion är initialt lokal eller systemisk. Systemiska blodinfektioner i kaudalvenen eller Kanal av Cuvier används oftast för att studera mikrobiella patogener i zebrafisk och är användbara för att studera interaktioner mellan värd och mikrobiella celler, cytokinsvar, och skillnader i virulens mellan patogenstammar. För långsammare växande mikroorganismer, kan tidig injektion i gulesäcken av ett embryo i 16-1,000 cellstadiet användas för att generera en systemisk infektion 13,14, med den optimala utvecklingsstadium för mikroinjektion av en långsamt växande mikroorganism befunnits vara mellan den 16-128 cellstadiet 15. Men gulesäcken injektioner av många mikrober i senare skeden av värdutvecklingen tenderar att vara dödlig till than värd på grund av näringsrika miljö för mikroben och brist på infiltrerande leukocyter 16-18.
En lokal infektion resulterar vanligen i riktad migration av leukocyter mot infektionsstället som lätt kan kvantifieras med icke-invasiv avbildning. Denna typ av infektion kan medge dissekering av de mekanismer som förmedlar leukocytmigrering samt utredning av olika flyttande och fagocytiska kapacitet olika leukocytpopulationer. Lokala infektioner är också användbara vid granskningen skillnader i virulens mellan bakteriestammar samt studera mikrob invasion mekanismer eftersom fysiska värd hinder måste korsas för en lokal infektion blir systemisk. Zebrafisk är vanligtvis upp vid temperaturer på 25-31 ° C 19, men de kan också hållas vid temperaturer så höga som 34-35 ° C för studier av invasions av vissa mänskliga patogener med stränga krav på temperaturför virulens 20, 21.
Många olika platser har använts för att generera en initialt lokaliserad bakteriell infektion inklusive bakhjäman ventrikeln 22, rygg svans muskel 18, perikardiell hålighet 23, och öron vesikler (öra) 5, 16, 24. Det har emellertid visat sig, att injektion av bakterier in svans muskel kan orsaka vävnadsskada och inflammation oberoende av de bakterier, som kan skeva resultat vid utredning leukocyt svar 13. Även mindre skador är associerad med injektion i bakhjäman och även om det är en början saknar leukocyter i unga embryon, bakhjäman ventrikeln vinner stadigt mer immunceller med tiden som mikroglia att bosätta. Bakhjäman ventrikeln är också en svårare plats till bilden. Öron vesikler är en sluten ihålig hålrum utan direkt tillgång till kärl 25, 26. Den är normalt saknar leukocytes, men leukocyter kan rekryteras till öron vesikler som svar på inflammatoriska stimuli såsom infektion. Det är också ett föredraget område av mikroinjektion av bakterier i zebrafisk i åldern 2-3 dagar efter befruktning (dpf) på grund av den lätthet med avbildning och visualisering av injektionen. Därför valde vi öron vesikler som vår webbplats för lokal bakteriell infektion.
Infektionen metod som används här är användbar för studium av värdens immunsvar mot ett initialt lokal infektion i 2-3 dpf-embryon och larver. Fokus för en inflammatorisk stimulus, såsom infektion, i en sluten hålighet, exempelvis öron vesikler möjliggör studier av neutrofila och makrofag kemotaxi och fagocytos. En varning för att injicera bakterier i öron vesikler är att möjligheten för neutrofiler att effektivt fagocytera bakterier i vätskefyllda hålrum kan vara beroende på den särskilda mikroben….
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka lab medlemmar för zebrafisk skötsel och underhåll. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health, National Research Service Award A155397 till EA Harvie och NIH R01GM074827 till Anna Huttenlocher.
1.7 ml eppendorfs | MidSci | AVSS1700 | |
14 ml falcon tube | BD Falcon | 352059 | |
27 G x 1/2 in. needle | BD Biosciences | 305109 | |
96 well plate | Corning Incorporated | 3596 | |
Agar | BD Biosciences | 214030 | |
CellTracker Red | Molecular Probes, Invitrogen | C34552 | |
CNA agar | Dot Scientific, Inc | 7126A | |
Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-7m | |
Dissecting Scope | Nikon | SMZ745 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
Ethanol 200 proof | MDS | 2292 | |
Fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Gel comb | VWR | 27372-482 | 4.2 mm width, 1.5 mm thick |
Glass bottom dishes | Custom made by drilling a 16–18 mm hole in the center of a 35-mm tissue culture dish bottom and placing a 22-mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light. | ||
Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
High melt agarose | Denville Scientific, Inc. | CA3510-6 | |
Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | with FV-1000 system | |
Low melt agarose | Fisher | BP165-25 | |
Magnetic stand | Tritech (Narishige) | GJ-1 | |
Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
Microloader pipet tips | Eppendorf | 930001007 | |
Micromanipulator | Tritech (Narishige) | M-152 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
Nanodrop spectrophotmeter | Thermo Scientific | ND-1000 | |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma aldrich | P7629 | |
Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 100 mm x 15 mm |
Phenol | Sigma Aldrich | P-4557 | |
Phenol Red | Ricca Chemoical Company | 572516 | |
Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
Potassium hydroxide | Sigma Aldrich | P-6310 | |
Pronase | Roche | 165921 | |
Protease peptone | Fluka Biochemika | 29185 | |
Small cell culture dish | Corning Incorporated | 430165 | 35 mm x 10 mm |
Sudan Black | Sigma Aldrich | S2380 | |
Thin wall glass capillary injection needles | World Precision Instruments, Inc. | TW100-3 | |
Todd Hewitt | Sigma Aldrich/Fluka Analytical | T1438 | |
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | Argent Chemical Laboratory/Finquel | C-FINQ-UE-100G | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Yeast extract | Fluka Biochemika | 92144 |