التصوير غير الغازية من الاستجابة المناعية الفطرية في نموذج الزرد يرقات<em> العقدية iniae</em> العدوى
Summary
Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.
Abstract
الممرض المائية، العقدية iniae، هي المسؤولة عن أكثر من 100 مليون دولار في خسائر سنوية لصناعة تربية الأحياء المائية، وقادر على التسبب في أمراض جهازية في كل من الأسماك والبشر. فهم أفضل للS. يتطلب iniae المرض والتسبب في نظام النموذج المناسب. وقابلية الإستطراق الجيني والشفافية البصرية من مراحل النمو المبكرة من الزرد تسمح لتوليد وغير الغازية التصوير من خطوط المعدلة وراثيا مع الموسومة fluorescently الخلايا المناعية. جهاز المناعة التكيفية ليست وظيفية بالكامل حتى عدة أسابيع بعد الإخصاب، ولكن اليرقات الزرد لديها الفقاريات المحفوظة نظام المناعة الفطري مع كل من العدلات والضامة. وهكذا، وتوليد نموذج العدوى اليرقات يسمح دراسة مساهمة محددة الحصانة الفطرية في السيطرة S. عدوى iniae.
سوف موقع حقن مكروي تحديد ما إذا كان وجود عدوى هوالنظامية أو محلية في البداية. هنا، نقدم بروتوكولات لدينا أذني حقن حويصلة من الزرد الذين تتراوح أعمارهم بين 2-3 أيام الإخصاب آخر فضلا عن تقنيات لدينا لتصوير مبائر الفلورسنت من العدوى. موقع عدوى موضعية يسمح مراقبة غزو ميكروب الأولي، وتجنيد الخلايا المضيفة ونشر العدوى. النتائج التي توصلنا إليها باستخدام نموذج اليرقات الزرد من S. عدوى iniae تشير إلى أن الزرد يمكن استخدامها لدراسة مساهمات مختلفة من العدلات المضيفة والضامة في الالتهابات البكتيرية المحلية. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف كيف يمكن استخدام photolabeling من الخلايا المناعية لتعقب المضيف فرد مصير خلية أثناء العدوى.
Introduction
العقدية iniae هو الممرض المائية الكبرى التي هي قادرة على التسبب في أمراض جهازية في كل من الأسماك والبشر 1. في حين S. iniae مسؤولة عن خسائر كبيرة في صناعة تربية الأحياء المائية، وإنما هو أيضا الممرض الحيوانية المحتملين، القادرة على إحداث أمراض في المضيف البشري المناعة مع الأمراض السريرية مشابهة لتلك التي تسببها أخرى مسببات الأمراض البشرية العقديات. ونظرا التشابه مع مسببات الأمراض البشرية، فمن المهم دراسة S. iniae المرض والتسبب في سياق مجموعة الطبيعي. نموذج الزرد الكبار من S. وكشف العدوى iniae تسلل قوي من الكريات البيض المضيف الى الموقع المترجمة من العدوى وكذلك وقت سريع لاستضافة الموت، وهو وقت قصير جدا لإشراك جهاز المناعة التكيفية 7. من اجل الحصول على نظرة متعمقة في الاستجابة المناعية الفطرية للS. iniae العدوى في الجسم الحي، فمن الضروري استخدام النموذج الذي هو أكثر قابلية لنعلى الغازية التصوير الحي.
الزرد اليرقات لديها عدد من المزايا التي تجعل من نموذج الفقاريات جذابة على نحو متزايد لدراسة التفاعلات المضيف الممرض. الزرد غير مكلفة نسبيا وسهلة الاستخدام والحفاظ مقارنة نماذج الثدييات. الحصانة التكيف ليست ناضجة وظيفيا حتى 4-6 أسابيع الإخصاب آخر، ولكن اليرقات لها الفقاريات حفظا للغاية نظام المناعة الفطري مع تكملة، تول مثل مستقبلات، السيتوكينات، والعدلات والضامة مع قدرات مضادة للميكروبات بما في ذلك البلعمة وانفجر الجهاز التنفسي 2-6، 8-11. وبالإضافة إلى ذلك، فإن قابلية الإستطراق الجيني والشفافية البصرية من المراحل الجنينية واليرقات للتنمية تسمح لتوليد خطوط المعدلة وراثيا مستقرة مع الخلايا المناعية fluorescently المسمى مما يجعل من الممكن لدراسة التفاعلات المضيف الممرض في الوقت الحقيقي في الجسم الحي. جيل من هذه خطوط المعدلة وراثيا باستخدام البروتين photoconvertible مثل دنdra2 يسمح لتتبع الفردي أصل الخلية المضيفة ومصير على مدار 12 إصابة.
عند وضع الزرد نموذج عدوى اليرقات، فإن الموقع المختار لحقن مكروي تحديد ما إذا كان وجود عدوى هو في البداية موضعية أو جهازية. وتستخدم الالتهابات الجهازية الدم في الوريد الذيلية أو القناة كوفييه الأكثر شيوعا لدراسة مسببات الأمراض الميكروبية في الزرد ومفيدة لدراسة التفاعلات بين المضيف والخلايا الميكروبية، والاستجابات خلوى، والاختلاف في الفوعة بين سلالات الممرض. لالكائنات الحية الدقيقة المتزايد أبطأ، والحقن في وقت مبكر في الكيس المحي من الجنين في مرحلة 16-1،000 الخلايا يمكن استخدامها لتوليد العدوى النظامية 13،14، مع مرحلة التطوير الأمثل ل microinjection من الكائنات الحية الدقيقة التي تشهد نموا بطيئا جدت لتكون بين المرحلة 16-128 خلية 15. ومع ذلك، صفار حقن SAC العديد من الميكروبات في مراحل لاحقة من التطور المضيف تميل إلى أن تكون قاتلة إلى tكان من المقرر أن تستضيف البيئة الغنية بالمغذيات للميكروب وعدم التسلل الكريات البيض 16-18.
عدوى موضعية عادة النتائج في الهجرة موجهة من الكريات البيض نحو موقع العدوى التي يمكن قياسها كميا بسهولة مع التصوير غير الغازية. هذا النوع من العدوى يمكن أن تسمح للتشريح للآليات التي تتوسط هجرة الكريات البيض وكذلك التحقيق في قدرات المهاجرة وأكلة مختلفة من مختلف السكان الكريات البيض. التهابات موضعية مفيدة أيضا عند دراسة الاختلافات في الفوعة بين السلالات البكتيرية وكذلك دراسة آليات الغزو ميكروب منذ الحواجز المادية المضيف يجب أن عبرت عن عدوى موضعية لتصبح النظامية. وعادة ما تثار الزرد عند درجة حرارة 25-31 ° C 19، ولكنها يمكن أيضا أن الحفاظ على درجات حرارة تصل إلى 34-35 درجة مئوية لمدة دراسات من الغزو من بعض مسببات الأمراض البشرية مع متطلبات درجة حرارة صارمةلالفوعة 20 و 21.
وقد استخدمت العديد من المواقع المختلفة لتوليد عدوى بكتيرية موضعية في البداية بما في البطين الدماغ المؤخر 22، الظهرية العضلات الذيل 18، جوف التامور 23، والحويصلة الأذنية (الأذن) 5، 16، 24. ومع ذلك، فقد وجد أن حقن البكتيريا في عضلة الذيل يمكن أن يسبب تلف الأنسجة والتهاب مستقلة عن البكتيريا، والتي قد تحرف النتائج عند التحقيق استجابة الكريات البيض 13. على الرغم من أن أقل ضرر يرتبط مع الحقن في الدماغ المؤخر وعلى الرغم من أنه يخلو في البداية من الكريات البيض في الأجنة الشباب، البطين الدماغ المؤخر مكاسب بشكل مطرد خلايا مناعية أكثر مع مرور الوقت كما تأخذ الخلايا الدبقية الصغيرة إقامة. البطين الدماغ المؤخر هو أيضا المكان أكثر صعوبة في الصورة. الحويصلة الأذنية هي تجويف جوفاء مغلقة مع أي الوصول المباشر إلى الأوعية الدموية 25 و 26. فمن عادة خالية من ليوkocytes، ولكن الكريات البيض يمكن تجنيدهم للالحويصلة الأذنية في الاستجابة للمثيرات الالتهابية مثل التهاب. وهو أيضا الموقع المفضل من Microinjection من البكتيريا في العمر الزرد 2-3 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) بسبب سهولة التصوير والتصور للحقن. لذلك، اخترنا الحويصلة الأذنية كما موقعنا من عدوى بكتيرية موضعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة العدوى المستخدم هنا هو مفيد لدراسة الاستجابة المناعية لعدوى موضعية في البداية في 2-3 أجنة DPF واليرقات. محور حافز التهابات، مثل العدوى، في تجويف مغلق مثل الحويصلة الأذنية يسمح لدراسة العدلات والبلاعم الكيميائي والبلعمة. التحذير واحدة من حقن البكتيريا في الحويصل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر أعضاء مختبر للرعاية الزرد والصيانة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة، جائزة الخدمة القومي للبحوث A155397 لEA هارفي وNIH R01GM074827 لآنا Huttenlocher.
Materials
| 1.7 ml eppendorfs | MidSci | AVSS1700 | |
| 14 ml falcon tube | BD Falcon | 352059 | |
| 27 G x 1/2 in. needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 96 well plate | Corning Incorporated | 3596 | |
| Agar | BD Biosciences | 214030 | |
| CellTracker Red | Molecular Probes, Invitrogen | C34552 | |
| CNA agar | Dot Scientific, Inc | 7126A | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-7m | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ethanol 200 proof | MDS | 2292 | |
| Fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gel comb | VWR | 27372-482 | 4.2 mm width, 1.5 mm thick |
| Glass bottom dishes | Custom made by drilling a 16–18 mm hole in the center of a 35-mm tissue culture dish bottom and placing a 22-mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light. | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| High melt agarose | Denville Scientific, Inc. | CA3510-6 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | with FV-1000 system | |
| Low melt agarose | Fisher | BP165-25 | |
| Magnetic stand | Tritech (Narishige) | GJ-1 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipet tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | Tritech (Narishige) | M-152 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Nanodrop spectrophotmeter | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma aldrich | P7629 | |
| Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 100 mm x 15 mm |
| Phenol | Sigma Aldrich | P-4557 | |
| Phenol Red | Ricca Chemoical Company | 572516 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Potassium hydroxide | Sigma Aldrich | P-6310 | |
| Pronase | Roche | 165921 | |
| Protease peptone | Fluka Biochemika | 29185 | |
| Small cell culture dish | Corning Incorporated | 430165 | 35 mm x 10 mm |
| Sudan Black | Sigma Aldrich | S2380 | |
| Thin wall glass capillary injection needles | World Precision Instruments, Inc. | TW100-3 | |
| Todd Hewitt | Sigma Aldrich/Fluka Analytical | T1438 | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | Argent Chemical Laboratory/Finquel | C-FINQ-UE-100G | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast extract | Fluka Biochemika | 92144 |
References
- Agnew, W., Barnes, A. C. Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination. Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).
- Danilova, N., Steiner, L. A. B cells develop in the zebrafish pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish. Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).
- Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).
- Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis. Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).
- Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio. Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).
- Meijer, A. H., et al. Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish. Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).
- Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio). Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).
- Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS ONE. 6 (2), e16779 (2011).
- Veneman, W. J., Marín-Juez, R., et al. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury. Cell. Microbiol. , (2012).
- Sar, A. M., et al. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).
- Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae. Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).
- Haddon, C., Lewis, J. Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
- Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -. Y., Phillips, B. Development of the zebrafish inner ear. Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
- Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
- Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).
