Summary

Неинвазивная Визуализация врожденного иммунного ответа в данио рерио личинок модели<em> Streptococcus iniae</em> Инфекция

Published: April 21, 2015
doi:

Summary

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Abstract

Водных патогенов, Streptococcus iniae, несет ответственность за более чем 100 миллионов долларов в ежегодных потерь для аквакультуры и способен вызывать системное заболевание в обоих рыбы и человека. Лучшее понимание S. Патогенез заболевания iniae требует соответствующей модели системы. Генетический уступчивость и оптической прозрачности на ранних стадиях развития в данио позволяют поколения и неинвазивной визуализации трансгенных линий с флуоресцентно помечены иммунные клетки. Адаптивная иммунная система функционирует не полностью, пока несколько недель не после оплодотворения, но данио личинки имеют сохраняется позвоночных врожденную иммунную систему, включающую как нейтрофилов и макрофагов. Таким образом, генерация личинок модели инфекции позволяет изучать конкретный вклад врожденного иммунитета в борьбе S. iniae инфекции.

Сайт микроинъекции будет определить, является ли инфекциясистемный или первично локализовано. Здесь мы представляем наши протоколы для слухового инъекции пузырьков из рыбок данио в возрасте 2-3 дней после оплодотворения, а также наших методов флуоресцентной конфокальной микроскопии инфекции. Локализуется инфекция сайт позволяет наблюдать за начальным микробов вторжения, набор клеток-хозяев и распространение инфекции. Наши результаты, используя данио личинок модель S. iniae инфекции показывают, что данио могут быть использованы для изучения различные взносы принимающих нейтрофилов и макрофагов в локализованных бактериальных инфекций. Кроме того, мы опишем, как photolabeling иммунных клеток может быть использована для отслеживания участи отдельные клетки-хозяина в ходе инфекции.

Introduction

Streptococcus iniae является одним из основных водных патогенов, которые способны вызвать системное заболевание и в рыбе и человека 1. В то время как S. iniae несет ответственность за больших потерь в отрасли аквакультуры, также потенциал зоонозных патогенов, способных вызвать заболевание у ослабленных людей хостов с клиническими патологиями подобных тем, которые вызваны другими стрептококковой патогенов человека. Учитывая, что его сходство с патогенами человека, важно изучить S. Патогенез болезни iniae в контексте естественного хозяина. Взрослых данио модель S. iniae инфекции показал надежную инфильтрацию лейкоцитов в принимающих локализованного места инфекции, а также к быстрому времени на проведение смерть, слишком малое время, чтобы включать в адаптивной иммунной системы 7. Для того, чтобы получить в глубокий взгляд на врожденного иммунного ответа к S. iniae инфекции в естественных условиях, необходимо использовать модель, более склонны к пна инвазивной живого изображения.

Личиночной данио имеет ряд преимуществ, которые делают его более привлекательным модель позвоночных для изучения хозяин-патоген взаимодействий. Данио рерио относительно недороги и просты в использовании и обслуживании по сравнению с моделями млекопитающих. Адаптивного иммунитета не является функционально зрелого до 4-6 недель после оплодотворения, но личинки имеют высоко консервативны позвоночных врожденной иммунной системы комплемента, с Toll-подобных рецепторов, цитокинов и нейтрофилов и макрофагов с антимикробными возможностей в том числе фагоцитоза и респираторного взрыва 2-6, 8-11. Кроме того, генетический трактабильность и оптическая прозрачность эмбриональных и личиночных стадий развития позволяет для генерации стабильных трансгенных линий с флуоресцентно меченые клетки иммунной системы, что делает его можно рассматривать хост-патоген взаимодействий в реальном времени в естественных условиях. Генерирование этих трансгенных линий с использованием photoconvertible белок, такой как Dendra2 позволяет отслеживать отдельные происхождения клетки-хозяина и судьбы на протяжении инфекции 12.

При разработке данио личинок модель инфекции, выбранное место микроинъекции будет определить, является ли инфекция первоначально локализовано или системным. Системные крови инфекции в хвостовую вену или в воздуховоде Кювье наиболее часто используется для изучения микробных патогенов в данио и полезны для изучения взаимодействий между хозяином и микробных клеток, ответов цитокинов, а также различия в вирулентности между штаммами возбудителя. Для более медленных растущих микроорганизмов, в начале инъекции в желточного мешка эмбриона на стадии 16-1,000 клеток могут быть использованы для генерации системной инфекции 13,14, с оптимальной стадии развития для микроинъекции медленно растущих микроорганизмов обнаружили, что между этап 16 до 128 клеток 15. Тем не менее, желточного мешка инъекции многих микробов на более поздних стадиях развития принимающей правило, смертельным для тон пройдет за счет богатой питательными веществами среды для микробов и отсутствие Лейкоциты проникают 16-18.

Локализованы инфекция обычно приводит к направленной миграции лейкоцитов по направлению к месту инфекции, которые могут быть легко количественно с неинвазивной визуализации. Этот тип инфекции может позволить для вскрытия механизмов, которые обеспечивают миграцию лейкоцитов, а также исследование различных миграционных и фагоцитирующих возможностей различных групп населения лейкоцитов. Локализованные инфекции также могут быть использованы при изучении различий в вирулентности между бактериальных штаммов, а также изучения механизмов вторжения микробов, так как физические барьеры хоста должно быть скрещенными за местной инфекции, чтобы стать системным. Данио рерио, как правило, поднял при температуре 25-31 ° С 19, но они также могут быть сохранены при температуре выше, чем 34-35 ° С в течение исследований инвазивности определенных патогенов человека с жесткими требованиями температурывирулентности 20, 21.

Много различных сайтов были использованы для создания изначально локализованного бактериальной инфекции, включая заднего мозга желудочка 22, спинной хвостовой мышцы 18, 23 полости перикарда и слухового пузырька (уха) 5, 16, 24. Тем не менее, было обнаружено, что введение бактерий в хвостовой мышцы может вызвать повреждение тканей и воспаление независимо от бактерий, которые могут исказить результаты при исследовании лейкоцитов ответ 13. Хотя и не столь ущерб, связанный с введением в мозге и, хотя это изначально лишены лейкоцитов у молодых эмбрионов, задний мозг желудочка постоянно получает больше иммунных клеток с течением времени, как микроглии выбирать местожительство. Задний мозг желудочка также более трудные локации к изображению. Слухового пузырька является замкнутую полую полость без прямого доступа к сосудистой 25, 26. Это, как правило, лишены Leukocytes, но лейкоциты могут быть привлечены к слуховым пузырьком в ответ на воспалительные стимулы, такие как инфекции. Это также предпочтительным местом микроинъекции бактерий в данио в возрасте 2-3 дней после оплодотворения (DPF) из-за легкости обработки изображений и визуализации инъекции. Таким образом, мы выбрали слухового пузырька как нашем сайте локализованного бактериальной инфекции.

Protocol

Взрослые и эмбриональные данио были сохранены в соответствии с Университетом Висконсин-Мэдисон исследования на животных ресурсного центра. 1. Подготовка микроинъекции Иглы Подготовка Тонкие стены иглы стеклянный капилляр инъекций (1,0 OD / 0,75 ID) с помощью микропипе?…

Representative Results

Микроинъекция S. iniae в слуховым пузырьком (рисунок 1 и рисунок 2) приводит к изначально локализованного ответа хозяина. При введении правильно, бактерии должны рассматриваться только в слуховой пузырек, а не в окружающих тканях или крови. Это могут быть визуализиро…

Discussion

Способ инфекции используется здесь, является полезным для изучения иммунного ответа на изначально локализованного инфекции в 2-3 DPF эмбрионов и личинок. В центре воспалительного стимула, таких как инфекции, в замкнутой полости, таких как слухового пузырька позволяет для изучения нейтр?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить членов лаборатории для рыбок данио ухода и обслуживания. Эта работа была выполнена при поддержке Национального института здравоохранения, Национальный исследовательский Service Award A155397 Е.А. Харви и NIH R01GM074827 Анне Huttenlocher.

Materials

1.7 ml eppendorfs MidSci AVSS1700
14 ml falcon tube BD Falcon 352059
27 G x 1/2 in. needle BD Biosciences 305109
96 well plate Corning Incorporated 3596
Agar BD Biosciences 214030
CellTracker Red Molecular Probes, Invitrogen C34552
CNA agar Dot Scientific, Inc 7126A
Disposable transfer pipets Fisher Scientific 13-711-7m
Dissecting Scope Nikon SMZ745
DMSO Sigma Aldrich D2650
Ethanol 200 proof MDS 2292
Fine tweezers Fine Science Tools 11251-20
Gel comb VWR 27372-482 4.2 mm width, 1.5 mm thick
Glass bottom dishes Custom made by drilling a 16–18 mm hole in the center of a 35-mm tissue culture dish bottom and placing a 22-mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light.
Glycerol Fisher Scientific G33-4
High melt agarose Denville Scientific, Inc. CA3510-6
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H325
Laser Scanning Confocal Microscope Olympus with FV-1000 system
Low melt agarose Fisher BP165-25
Magnetic stand Tritech (Narishige) GJ-1
Microinjection system Parker Picospritzer III
Microloader pipet tips Eppendorf 930001007
Micromanipulator Tritech (Narishige) M-152
Micropipette puller Sutter Instrument Company Flaming/Brown P-97
Nanodrop spectrophotmeter Thermo Scientific ND-1000
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma aldrich P7629
Paraformaldheyde Electron Microscopy Sciences 15710
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875712 100 mm x 15 mm
Phenol Sigma Aldrich P-4557
Phenol Red Ricca Chemoical Company 572516
Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP665-1
Potassium hydroxide Sigma Aldrich P-6310
Pronase Roche 165921
Protease peptone Fluka Biochemika 29185
Small cell culture dish Corning Incorporated 430165 35 mm x 10 mm
Sudan Black Sigma Aldrich S2380
Thin wall glass capillary injection needles World Precision Instruments, Inc. TW100-3
Todd Hewitt Sigma Aldrich/Fluka Analytical T1438
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) Argent Chemical Laboratory/Finquel C-FINQ-UE-100G
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Yeast extract Fluka Biochemika 92144

References

  1. Agnew, W., Barnes, A. C. Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination. Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).
  2. Danilova, N., Steiner, L. A. B cells develop in the zebrafish pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).
  3. Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
  4. Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish. Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).
  5. Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
  6. Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).
  7. Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis. Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).
  8. Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio. Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).
  9. Meijer, A. H., et al. Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish. Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).
  10. Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio). Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).
  11. Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).
  12. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
  13. Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).
  14. Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS ONE. 6 (2), e16779 (2011).
  15. Veneman, W. J., Marín-Juez, R., et al. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), (2014).
  16. Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury. Cell. Microbiol. , (2012).
  17. Sar, A. M., et al. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).
  18. Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
  19. Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
  20. He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
  21. Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).
  22. Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  23. Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).
  24. Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae. Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).
  25. Haddon, C., Lewis, J. Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
  26. Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -. Y., Phillips, B. Development of the zebrafish inner ear. Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).
  27. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
  28. Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).
  29. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
  30. Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).

Play Video

Cite This Article
Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection. J. Vis. Exp. (98), e52788, doi:10.3791/52788 (2015).

View Video