Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.
Vann patogen, Streptococcus iniae, er ansvarlig for over 100 millioner dollar i årlig tap for oppdrettsnæringen og er i stand til å forårsake systemisk sykdom hos både fisk og mennesker. En bedre forståelse av S. iniae sykdom patogenesen krever en passende modell system. Den genetiske tractability og den optiske åpenhet av de tidlige utviklingsstadier av sebrafisk tillate for generering og ikke-invasiv bildediagnostikk av transgene linjer med fluorescently merket immunceller. Den adaptive immunsystem er ikke fullt funksjonell før flere uker etter befruktning, men sebrafisk larver har et konservert virveldyr medfødte immunsystemet med både nøytrofile granulocytter og makrofager. Således, generering av et larveinfeksjonsmodell tillater studiet av det bestemte bidrag fra medfødt immunitet i å kontrollere S. iniae infeksjon.
Stedet for mikroinjeksjon vil avgjøre om en infeksjon ersystemisk eller opprinnelig lokalisert. Her presenterer vi våre protokoller for otic vesikkel injeksjon av sebrafisk alderen 2-3 dager etter befruktning, så vel som våre teknikker for fluorescerende konfokal avbildning av infeksjon. En lokalisert infeksjon Nettstedet tillater observasjon av første mikrobe invasjon, rekruttering av vertsceller og formidling av infeksjon. Våre funn ved hjelp av sebrafisk larve modell av S. iniae infeksjon indikerer at sebrafisk kan anvendes for å undersøke de forskjellige bidrag fra verts neutrofiler og makrofager i lokaliserte bakterielle infeksjoner. I tillegg, vil vi beskrive hvordan photolabeling av immunceller kan benyttes for å spore individuelle vertscelle skjebne i løpet av infeksjonen.
Streptococcus iniae er en viktig patogen akvatisk som er i stand til å forårsake systemiske sykdom hos både fisk og mennesker 1. Mens S. iniae er ansvarlig for store tap i oppdrettsnæringen, er det også en potensiell zoonotiske patogen, stand til å forårsake sykdom hos immunsupprimerte menneskelige verter med kliniske patologi som ligner på de som er forårsaket av andre streptokokker menneskelige patogener. Gitt sine likheter med menneskelige patogener, er det viktig å studere S. iniae sykdom patogenesen i sammenheng med en naturlig vert. En voksen sebrafisk modell av S. iniae infeksjon viste sterk infiltrering av verts leukocytter til det lokaliserte område for infeksjon så vel som en hurtig tid til å være vert for død, til en tid for kort bære det adaptive immunsystemet 7. For å få en grundig titt inn i det medfødte immunrespons mot S. iniae infeksjon in vivo, er det nødvendig å anvende en modell som er mer mottagelig for non-invasiv levende avbildning.
Larvesebrafisk har en rekke fordeler som gjør det til et stadig mer attraktivt virveldyr modell for å studere vert-patogen interaksjoner. Sebrafisk er relativt billig og lett å bruke og vedlikeholde i forhold til pattedyrmodeller. Adaptiv immunitet er ikke funksjonelt moden før 4-6 uker etter befruktning, men larver har et høyt konservert virveldyr medfødte immunsystemet med komplement, Toll-lignende reseptorer, cytokiner, og nøytrofile og makrofager med antimikrobielle evner inkludert fagocytose og åndedretts burst 2-6, 8-11. I tillegg er det genetiske tractability og optisk transparens av embryonale og larveutviklingsstadier tillate dannelsen av stabile transgene linjer med fluorescensmerkede immunceller som gjør det mulig å undersøke vert-patogen vekselvirkninger i sanntid in vivo. Generering av disse transgene linjer ved hjelp av en photoconvertible protein som Dendra2 gir mulighet for sporing av individuelle vertscelle opprinnelse og skjebne i løpet av 12 infeksjon.
Ved utvikling av en sebrafisk larveinfeksjonsmodell, vil det valgte området av mikroinjeksjon avgjøre om en infeksjon er i utgangspunktet lokalisert eller systemisk. Systemiske blod infeksjoner i halevenen eller Duct av Cuvier er mest brukt til å studere mikrobielle patogener i sebrafisk og er nyttige for å studere samspillet mellom vert og mikrobielle celler, cytokin svar, og forskjeller i virulens mellom patogene stammer. For langsommere voksende mikroorganismer, kan tidlig injeksjon i plommesekken fra et embryo i 16-1,000 cellestadiet brukes til å generere en systemisk infeksjon 13,14, med den optimale utviklingsstadiet for mikroinjeksjon av en saktevoksende mikroorganisme funnet å være mellom den 16-128 cellestadiet 15. Imidlertid plommesekken injeksjoner av mange mikrober på senere stadier av verts utvikling tendens til å være dødelig for than vert på grunn av næringsrikt miljø for mikroben og mangel på infiltrere leukocytter 16-18.
En lokalisert infeksjon resulterer vanligvis i rettet migrasjon av leukocytter mot infeksjonsstedet som lett kan kvantifiseres med ikke-invasiv bildediagnostikk. Denne typen infeksjon kan gi rom for disseksjon av mekanismene som formidler leukocyttmigrering samt undersøkelse av forskjellige trekkende og fagocytiske evner av ulike leukocyttpopulasjoner. Lokaliserte infeksjoner er også nyttig når undersøke forskjeller i virulens mellom bakteriestammer samt studere mikrobe invasjonsmekanismer siden fysiske verts barrierer må krysses for en lokalisert infeksjon å bli systemisk. Sebrafisk blir typisk hevet ved temperaturer på 25-31 ° C 19, men de kan også opprettholdes ved temperaturer så høye som 34 til 35 ° C for studier av invasivitet av visse humane patogener med krav strenge temperaturfor virulens 20, 21.
Mange forskjellige områder har blitt brukt til å generere en innledningsvis lokalisert bakteriell infeksjon, inkludert hindbrain hjertekammer 22, dorsal halemuskelen 18, pericardial hulrommet 23, og otisk vesikkel (øre) 5, 16, 24. Det har imidlertid vist seg at injeksjon av bakterier inn i halemuskelen kan forårsake vevsskade og betennelse uavhengig av bakterier, som kan skew resultater ved å undersøke leukocytt-respons 13. Selv om mindre skade er forbundet med injeksjon i hindbrain og selv om det i utgangspunktet er fritt for leukocytter i små embryoer, hindbrain ventrikkel stadig får mer immune celler over tid som mikroglia ta opphold. Hindbrain ventrikkel er også mer vanskelig sted til bildet. Otic vesikkel er en lukket hul hulrom uten direkte tilgang til vaskulaturen 25, 26. Det er normalt blottet for leukocytes, men leukocytter kan rekrutteres til otic vesikkel som svar på inflammatoriske stimuli som infeksjon. Det er også et foretrukket område av mikroinjeksjon av bakterier i sebrafisk alderen 2-3 dager etter befruktning (DPF) på grunn av den enkle bildebehandling og visualisering av injeksjonen. Derfor valgte vi otic vesikkel som vår side av lokalisert bakteriell infeksjon.
Infeksjonen metode som brukes her er nyttig for studier av vertens immunrespons til en først lokalisert infeksjon i 2-3 DPF befruktede egg og larver. Fokus for en inflammatorisk stimulus, slik som infeksjoner, i et lukket hulrom som otic vesikkel tillater studiet av nøytrofile granulocytter og makrofag kjemotakse og fagocytose. En påminnelse for injisering av bakterier i otic vesikkel er at evnen av nøytrofiler til effektivt fagocyttere bakterier i væskefylte hulrom kan være avhengig av den spesielle mikrobe. Selv…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke lab medlemmer for sebrafisk stell og vedlikehold. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health, National Research Service Award A155397 til EA Harvie og NIH R01GM074827 til Anna Huttenlocher.
1.7 ml eppendorfs | MidSci | AVSS1700 | |
14 ml falcon tube | BD Falcon | 352059 | |
27 G x 1/2 in. needle | BD Biosciences | 305109 | |
96 well plate | Corning Incorporated | 3596 | |
Agar | BD Biosciences | 214030 | |
CellTracker Red | Molecular Probes, Invitrogen | C34552 | |
CNA agar | Dot Scientific, Inc | 7126A | |
Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-7m | |
Dissecting Scope | Nikon | SMZ745 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
Ethanol 200 proof | MDS | 2292 | |
Fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Gel comb | VWR | 27372-482 | 4.2 mm width, 1.5 mm thick |
Glass bottom dishes | Custom made by drilling a 16–18 mm hole in the center of a 35-mm tissue culture dish bottom and placing a 22-mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light. | ||
Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
High melt agarose | Denville Scientific, Inc. | CA3510-6 | |
Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | with FV-1000 system | |
Low melt agarose | Fisher | BP165-25 | |
Magnetic stand | Tritech (Narishige) | GJ-1 | |
Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
Microloader pipet tips | Eppendorf | 930001007 | |
Micromanipulator | Tritech (Narishige) | M-152 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
Nanodrop spectrophotmeter | Thermo Scientific | ND-1000 | |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma aldrich | P7629 | |
Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 100 mm x 15 mm |
Phenol | Sigma Aldrich | P-4557 | |
Phenol Red | Ricca Chemoical Company | 572516 | |
Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
Potassium hydroxide | Sigma Aldrich | P-6310 | |
Pronase | Roche | 165921 | |
Protease peptone | Fluka Biochemika | 29185 | |
Small cell culture dish | Corning Incorporated | 430165 | 35 mm x 10 mm |
Sudan Black | Sigma Aldrich | S2380 | |
Thin wall glass capillary injection needles | World Precision Instruments, Inc. | TW100-3 | |
Todd Hewitt | Sigma Aldrich/Fluka Analytical | T1438 | |
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | Argent Chemical Laboratory/Finquel | C-FINQ-UE-100G | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Yeast extract | Fluka Biochemika | 92144 |