की एक zebrafish लारवल मॉडल में सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के गैर इनवेसिव इमेजिंग<em> स्ट्रेप्टोकोकस iniae</em> संक्रमण
Summary
Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.
Abstract
जलीय रोगज़नक़, स्ट्रैपटोकोकस iniae, मत्स्य उद्योग के लिए वार्षिक घाटे में 100 मिलियन डॉलर से अधिक के लिए जिम्मेदार है और मछली और मनुष्य दोनों में प्रणालीगत रोग पैदा करने में सक्षम है। एस का एक बेहतर समझ iniae रोग रोगजनन एक उपयुक्त मॉडल प्रणाली की आवश्यकता है। fluorescently प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ टैग आनुवंशिक Tractability और zebrafish के प्रारंभिक विकास के चरणों के ऑप्टिकल पारदर्शिता ट्रांसजेनिक लाइनों की पीढ़ी और गैर इनवेसिव इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं। कई हफ्तों के निषेचन पोस्ट तक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली को पूरी तरह से कार्य नहीं है, लेकिन zebrafish लार्वा न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज दोनों के साथ एक संरक्षित कशेरुकी सहज प्रतिरक्षा प्रणाली है। इस प्रकार, एक लार्वा संक्रमण मॉडल की पीढ़ी एस को नियंत्रित करने में सहज उन्मुक्ति के विशिष्ट योगदान के अध्ययन के लिए अनुमति देता है iniae संक्रमण।
microinjection की साइट एक संक्रमण है तय करेंगे कि क्याप्रणालीगत या शुरू में स्थानीयकृत किया गया। यहाँ, हम कान पुटिका zebrafish आयु वर्ग के 2-3 दिन बाद निषेचन के इंजेक्शन के रूप में अच्छी तरह से संक्रमण के फ्लोरोसेंट confocal इमेजिंग के लिए हमारी तकनीक के लिए हमारे प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एक स्थानीय संक्रमण साइट प्रारंभिक सूक्ष्म जीव आक्रमण का अवलोकन, मेजबान कोशिकाओं की भर्ती और संक्रमण के प्रसार की अनुमति देता है। एस के लिए zebrafish लार्वा मॉडल का उपयोग कर हमारा निष्कर्ष iniae संक्रमण zebrafish स्थानीयकृत जीवाणु संक्रमण में मेजबान न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज के भिन्न योगदान की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि संकेत मिलता है। इसके अलावा, हम प्रतिरक्षा कोशिकाओं के photolabeling संक्रमण के दौरान अलग-अलग मेजबान सेल भाग्य पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कैसे का वर्णन।
Introduction
स्ट्रेप्टोकोकस iniae मछली और मनुष्यों 1 दोनों में प्रणालीगत रोग पैदा करने में सक्षम है कि एक प्रमुख जलीय रोगजनक है। एस जबकि iniae जलीय कृषि उद्योग में बड़े नुकसान के लिए जिम्मेदार है, यह भी अन्य स्ट्रेपटोकोकल मानव रोगज़नक़ों की वजह से उन लोगों के लिए इसी तरह की नैदानिक विकृतियों के साथ प्रतिरक्षा अक्षमता मानव मेजबानों में रोग पैदा करने में सक्षम एक संभावित जूनोटिक रोगजनक है। मानव रोगज़नक़ों के साथ इसकी समानता को देखते हुए यह एस अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है एक प्राकृतिक मेजबान के संदर्भ में iniae रोग रोगजनन। एस के एक वयस्क zebrafish मॉडल iniae संक्रमण संक्रमण के स्थानीयकृत स्थल के रूप में अच्छी तरह से मौत की मेजबानी के लिए एक तेजी से समय के लिए मेजबान leukocytes के मजबूत घुसपैठ का पता चला, बहुत कम समय अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली 7 को शामिल करने के लिए। हासिल करने के लिए आदेश में एक में गहराई से एस के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर गौर vivo में संक्रमण iniae, यह n के लिए उत्तरदायी है कि एक मॉडल का उपयोग करने के लिए आवश्यक हैपर आक्रामक रहते इमेजिंग।
लार्वा zebrafish यह मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन के लिए एक तेजी से आकर्षक हड्डीवाला मॉडल बनाने कि लाभ का एक नंबर है। Zebrafish का उपयोग करें और स्तनधारी मॉडल की तुलना में बनाए रखने के लिए अपेक्षाकृत सस्ती और आसान कर रहे हैं। अनुकूली उन्मुक्ति 4-6 सप्ताह के बाद निषेचन तक कार्यात्मक रूप से परिपक्व नहीं है, लेकिन लार्वा phagocytosis और सांस फट 2-6 सहित रोगाणुरोधी क्षमताओं के साथ पूरक, टोल की तरह रिसेप्टर्स, साइटोकिन्स, और neutrophils और मैक्रोफेज के साथ एक उच्च संरक्षित कशेरुकी सहज प्रतिरक्षा प्रणाली है, 8-11। इसके अलावा, आनुवंशिक Tractability और विकास का भ्रूण और लार्वा चरणों के ऑप्टिकल पारदर्शिता के साथ fluorescently लेबल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए यह संभव विवो में वास्तविक समय में मेजबान रोगज़नक़ बातचीत की जांच के लिए बना स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों की पीढ़ी के लिए अनुमति देते हैं। ऐसे अड्डे के रूप में एक photoconvertible प्रोटीन का उपयोग कर इन ट्रांसजेनिक लाइनों की पीढ़ीdra2 संक्रमण 12 के पाठ्यक्रम पर व्यक्तिगत मेजबान सेल मूल और भाग्य की ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है।
एक zebrafish लार्वा संक्रमण मॉडल विकसित करते हैं, microinjection की चुना साइट एक संक्रमण शुरू में स्थानीय या प्रणालीगत है कि क्या यह निर्धारित होगा। दुम नस या कुवियर की वाहिनी में प्रणालीगत खून में संक्रमण आमतौर पर सबसे अधिक zebrafish में माइक्रोबियल रोगज़नक़ों अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया और रोगज़नक़ उपभेदों के बीच डाह में मेजबान और माइक्रोबियल कोशिकाओं, साइटोकाइन प्रतिक्रियाओं, और मतभेदों के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं। धीमी बढ़ रही सूक्ष्मजीवों के लिए, 16-1,000 सेल मंच पर एक भ्रूण की जर्दी थैली में जल्दी इंजेक्शन के बीच हो पाया एक धीमी गति से बढ़ रही है सूक्ष्मजीव के microinjection के लिए इष्टतम विकास मंच के साथ, एक प्रणालीगत संक्रमण 13,14 उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 16-128 सेल चरण 15। हालांकि, मेजबान विकास के बाद के चरणों में कई रोगाणुओं की थैली इंजेक्शन जर्दी टी के लिए घातक हो जाते हैंवह ल्यूकोसाइट्स 16-18 घुसपैठ की सूक्ष्म जीव और कमी के लिए पोषक तत्वों से भरपूर वातावरण के कारण मेजबान।
एक स्थानीय संक्रमण आमतौर पर आसानी से गैर इनवेसिव इमेजिंग के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है कि संक्रमण के स्थल की ओर leukocytes के निर्देशित प्रवास में यह परिणाम है। संक्रमण के इस प्रकार के ल्युकोसैट प्रवास के साथ ही विभिन्न ल्युकोसैट आबादी के विभिन्न प्रवासी और phagocytic क्षमताओं की जांच मध्यस्थता कि तंत्र का विच्छेदन के लिए अनुमति दे सकते हैं। जीवाणु उपभेदों के बीच डाह में मतभेद की जांच करने के साथ ही शारीरिक मेजबान बाधाओं प्रणालीगत बनने के लिए एक स्थानीय संक्रमण के लिए पार किया जाना चाहिए के बाद से सूक्ष्म जीव आक्रमण तंत्र के अध्ययन जब स्थानीयकृत संक्रमण भी उपयोगी होते हैं। Zebrafish आम तौर पर 25-31 डिग्री सेल्सियस 19 के तापमान पर उठाए गए हैं, लेकिन वे भी सख्त तापमान आवश्यकताओं के साथ कुछ मानव रोगज़नक़ों के invasiveness की पढ़ाई के लिए 34-35 डिग्री सेल्सियस के रूप में उच्च तापमान पर रखा जा सकता हैडाह 20, 21 के लिए।
कई अलग अलग साइटों hindbrain निलय 22 पृष्ठीय पूंछ पेशी 18, पेरिकार्डियल गुहा 23, और कान का पुटिका (कान) 5, 16, 24 सहित एक शुरू में स्थानीयकृत जीवाणु संक्रमण उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, यह ल्युकोसैट प्रतिक्रिया 13 की जांच परिणाम जब तिरछा कर सकते हैं, जो बैक्टीरिया के ऊतकों को नुकसान और सूजन स्वतंत्र पैदा कर सकता है पूंछ मांसपेशी में बैक्टीरिया की है कि इंजेक्शन पाया गया है। कम नुकसान hindbrain में इंजेक्शन के साथ जुड़ा हुआ है और यह युवा भ्रूण में leukocytes के शुरू में रहित है, हालांकि microglia ले निवास के रूप में, hindbrain निलय में तेजी से समय के साथ अधिक प्रतिरक्षा कोशिकाओं लाभ है, यद्यपि। hindbrain निलय भी छवि के लिए एक और अधिक कठिन स्थान है। कान पुटिका vasculature के 25, 26 के लिए कोई सीधी पहुँच के साथ एक बंद खोखले गुहा है। यह लियू की सामान्य रूप से रहित हैkocytes, लेकिन ल्यूकोसाइट्स ऐसे संक्रमण के रूप में भड़काऊ उत्तेजनाओं के जवाब में कान का पुटिका के लिए भर्ती किया जा सकता है। यह इसलिए भी क्योंकि इमेजिंग की आसानी और इंजेक्शन के दृश्य के लिए zebrafish आयु वर्ग के 2-3 दिन बाद निषेचन (DPF) में जीवाणुओं की microinjection की एक पसंदीदा स्थल है। इसलिए, हम स्थानीयकृत जीवाणु संक्रमण के बारे में हमारी साइट के रूप में कान का पुटिका चुना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां इस्तेमाल किया संक्रमण विधि 2-3 DPF भ्रूण और लार्वा में एक शुरू में स्थानीयकृत संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए उपयोगी है। ऐसे कान पुटिका के रूप में एक बंद गुहा में इस तरह …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों zebrafish देखभाल और रखरखाव के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, ईए Harvie करने के लिए राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा पुरस्कार A155397 और अन्ना Huttenlocher एनआईएच R01GM074827 द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| 1.7 ml eppendorfs | MidSci | AVSS1700 | |
| 14 ml falcon tube | BD Falcon | 352059 | |
| 27 G x 1/2 in. needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 96 well plate | Corning Incorporated | 3596 | |
| Agar | BD Biosciences | 214030 | |
| CellTracker Red | Molecular Probes, Invitrogen | C34552 | |
| CNA agar | Dot Scientific, Inc | 7126A | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-7m | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ethanol 200 proof | MDS | 2292 | |
| Fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gel comb | VWR | 27372-482 | 4.2 mm width, 1.5 mm thick |
| Glass bottom dishes | Custom made by drilling a 16–18 mm hole in the center of a 35-mm tissue culture dish bottom and placing a 22-mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light. | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| High melt agarose | Denville Scientific, Inc. | CA3510-6 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | with FV-1000 system | |
| Low melt agarose | Fisher | BP165-25 | |
| Magnetic stand | Tritech (Narishige) | GJ-1 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipet tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | Tritech (Narishige) | M-152 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Nanodrop spectrophotmeter | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma aldrich | P7629 | |
| Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 100 mm x 15 mm |
| Phenol | Sigma Aldrich | P-4557 | |
| Phenol Red | Ricca Chemoical Company | 572516 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Potassium hydroxide | Sigma Aldrich | P-6310 | |
| Pronase | Roche | 165921 | |
| Protease peptone | Fluka Biochemika | 29185 | |
| Small cell culture dish | Corning Incorporated | 430165 | 35 mm x 10 mm |
| Sudan Black | Sigma Aldrich | S2380 | |
| Thin wall glass capillary injection needles | World Precision Instruments, Inc. | TW100-3 | |
| Todd Hewitt | Sigma Aldrich/Fluka Analytical | T1438 | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | Argent Chemical Laboratory/Finquel | C-FINQ-UE-100G | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast extract | Fluka Biochemika | 92144 |
References
- Agnew, W., Barnes, A. C. Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination. Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).
- Danilova, N., Steiner, L. A. B cells develop in the zebrafish pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish. Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).
- Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).
- Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis. Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).
- Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio. Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).
- Meijer, A. H., et al. Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish. Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).
- Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio). Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).
- Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS ONE. 6 (2), e16779 (2011).
- Veneman, W. J., Marín-Juez, R., et al. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury. Cell. Microbiol. , (2012).
- Sar, A. M., et al. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).
- Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae. Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).
- Haddon, C., Lewis, J. Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
- Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -. Y., Phillips, B. Development of the zebrafish inner ear. Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
- Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
- Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).
