Summary

산화 DNA 바이오 마커의 HPLC 측​​정, -8- 옥소 -7,8- 디 하이드로 -2'- 데 옥시 구아노 신, 배양 세포와 동물 조직

Published: August 01, 2015
doi:

Summary

이 프로토콜의 목적은 DNA 산화 마커의 검출이다 -8- 옥소 -7,8- 디 하이드로 -2'- 데 옥시 구아노 배양 된 세포 또는 동물 조직으로부터 DNA (8 옥소 dGuo) HPLC-ED 의해.

Abstract

산화 스트레스는 DNA를 포함한 생체 거대 분자의 산화로 이어지는 많은 생리 학적 및 병리학 적 과정뿐만 아니라, 생체 이물 대사와 관련된다. 따라서, DNA의 산화를 효율적으로 검출은 의학 및 독성학 연구 분야를 포함한 다양한 중요하다. 산화 적 DNA 손상의 일반적인 바이오 마커는 -8- 옥소 -7,8- 디 하이드로 -2'- 데 옥시 구아노 신 (8 옥소 dGuo이다 종종 잘못이라 -8- 하이드 록시 -2'- 데 옥시 구아노 신 (8-OH-dGuo 8 옥소 – DG)). 전기 화학적 검출 (HPLC-ED)와 고압 액체 크로마토 그래피로 -8- 옥소 dGuo 측정을위한 여러 프로토콜들이 설명되었다. 그러나, 이들은 주로 산화 촉진제로 처리 DNA 정제에 적용 하였다. 또한, 때문에 주로 분석 장비의 차이에 실험실 사이의 방법 론적 차이에, HPLC-ED 8 옥소 dGuo의 검출을위한 공개 방법의 채택은 각 실험실에 의해 조심 최적화가 필요합니다.이러한 최적화 과정을 설명하는 포괄적 인 프로토콜은 결여되어있다. 여기서, 상세한 프로토콜은 배양 된 세포 또는 동물 조직으로부터 DNA에 의해 HPLC-ED -8- 옥소 dGuo의 검출에 대하여 설명한다. 이는 DNA 샘플 제조 용이하고 신속하게 샘플 제조 동안 발생할 수있는 바람직하지 않은 DNA의 산화를 최소화하기 위해 최적화 될 수있는 방법을 예시한다. 이 프로토콜은 산화제 KBrO 3 처리 배양 된 폐포 선암 세포 (즉, A549 세포)에 -8- 옥소 dGuo를 검출하고, 다환 방향족 탄화수소 디 벤조 (DEF, P) 크리 센에 노출 된 마우스의 비장에서하는 방법을 보여준다 (구 디 벤조 (A, L) 피렌로 알려진 DBC, DalP). 전반적으로,이 작품은 HPLC-ED의 방법론은 쉽게 생체 시료 8 옥소 dGuo의 검출에 최적화 할 수있는 방법을 보여줍니다.

Introduction

누구의 정상 상태 수준의 많은 병리학 적 조건 xenotoxic 대사 중에 증가 할 수 반응성 산소 종 (ROS)는, 산화 DNA 손상의 빈도 증가에 기여한다. 여러 가지 뉴 클레오 산화 생성물 중 산화성 DNA 손상이 용이하게 안정 마커를 사용하여 측정 할 수 -8- 옥소 -7,8- 디 하이드로 -2'- 데 옥시 구아노 신 (2)의 산화 된 형태 중 하나이다 (8- 옥소 dGuo) ' -deoxyguanosine (dGuo) 1. -8- 옥소 dGuo 따라서, 여러 DNA 산화 생성물 (3)의 존재에도 불구하고 DNA 산화 등의 바이오 마커에 ​​더 상세히 연구되어, 가장 풍부한 DNA 병변 2이고. 인간에있어서, 이러한 손상은 8 oxoguanine 글리코 1 (hOGG1) (4)에 의해 염기 절제 복구를 통해 복구 될 수있다. 수리되지두면 -8- 옥소 dGuo베이스 페어 치환 돌연변이의 형성 (즉, G는 transversions를 T로)에 기여할 수있다 (4). 중요한 -8- 옥소 dGuo은 확립 마커 FO는시작과 암 발생이 촉진 관련 R의 DNA 손상. 따라서 -8- 옥소 dGuo의 정확한 정량화는 산화 적 DNA 손상 (5)의 유용하고 바람직한 바이오 마커이다.

또한, 화합물 (들)의 정확한 이름 일상적 산화성 DNA 손상 (6)의 바이오 마커로서 측정 산화 손상-2- 데 옥시 구아노 형태 및 대한 정확한 명칭에 관한 문헌에서 광범위 혼란이있다. -8- 옥소 dGuo (도 1에 도시)의 6,8- 디케 및 6- 에놀 8 케토 호변 이성질체 형태는 문헌에서 논의 5,7- 개의 가장 두드러진 호변이다. 6,8- 디케 형태는 7.4의 생리 학적 pH에서 가장 두드러진 형태이고, 가장 눈에 띄는 DNA 산화 생성물 7이다. 따라서 -8- 옥소 dGuo가 아닌 8- 히드 록시 dGuo이 산화 생성물 (6)에 대해 가장 적절한 이름이다. 그것은 오히려 nucleob보다, 그 2 구아노 (dGuo)을주의하는 것이 중요하다ASE의 구아닌 (GUA) 또는 리보 구아노 신 (구오)는 각각 대부분의 방법 (6)에 의해 검출된다.

정확한 검출 및 -8- 옥소 dGuo의 정량화 인해 도전 : DNA 샘플의 소화 I)의 변동, ⅱ) 외래성 샘플 제조 동안 발생할 수 -8- 옥소 dGuo에 dGuo의 산화, 및 ⅲ) 필요 분석 HPLC-ED 방법 (8)의 효과 검증을위한. 이 프로토콜에서, 우리는 완전한 DNA 소화에 유리 및 II) 함유 금속 킬 레이터 및 킬 레이터 처리 용액 및 특별한 DNA 분리 용 시약에 의해 ⅲ) 부분적으로 만의 포함에 의해 해결되는 동안의 조건을 제공함으로써 i)를 달성하는 것을 목표 양성 대조군은 따라서 방법은 생물학적 샘플에서 -8- 옥소 dGuo를 검출 할 수있는 것을 제공한다. 또한 검증은이 문서의 범위를 벗어납니다. 그러나, 우리는이 프로토콜은 미래의 도움이 될 것으로 확신한다사용자들은 그들 자신의 정식 목적에 따라 프로토콜을 검증 할 필요가있는 범위를 결정한다. 방법의 형식적인 검증을 위해 필요한 단계의리스트를 더 제공된다. 8 옥소 dGuo 검출을위한 방법의 개발 및 배포하는 동안, 출판 방법을 검토하고 통합했다. 따라서,이 방법은 8 옥소 dGuo의 검출 및 정량 방법을 성공적으로 채택되어있는 경우도 시험을 신속하고 간단한 방법을 제공하는 동시에 자주 중요한 실험 세부 결여 여러 공개 소스로부터 정보를 수집 할 필요가 없다. 이 적응 방법은 성공적으로 배양 된 세포 및 조직에서 쥐의 DNA 시료를 분석하는 데 이용 하였다. 이 비디오 기사는 HPLC-ED에 의해 신뢰할 수있는 탐지 및 8 옥소 dGuo의 정량화를위한​​ 효과적인 방법을 확립 다른 그룹에 도움이 될 것입니다.

Protocol

확인 모든 축산, 주택, 처리 및 실험이 지역의 규칙과 규정을 준수하고 실험 프로토콜이 어떤 연구를 시작하기 전에 승인됩니다. 설명 실험을 위해, 동물 보호, 처리, 치료는 건강 캐나다 동물 관리위원회에 의해 승인되었다. 공급 업체의 자세한 내용은 "시약 테이블"을 참조하십시오. 1. 생체 시료 수집 세포 또는 동물의 조직 10 % 소 태아 혈청, 페니실린…

Representative Results

dGuo 8 옥소 dGuo 약 6.4 분 (도 2A와 B)의 체류 시간을 가졌다 반면, 4.7 분의 체류 시간이 관찰되었다. 도 2c에 도시 된 바와 같이 두 가지 분석 물질 간의 피크 높이의 약 1,000 배의 차이가있다. -8- 옥소 dGuo 및 dGuo위한 볼타 모 그램은 +1.1 +0.2 V로의 범위의 작동 전위로 실행 표준 얻었다 -8- 옥소 dGuo위한 최적의 작동 전위 +0.5 V 및 +0.9를 측정되었다 dGuo에 대한 V (그림 3).</stron…

Discussion

8 옥소 dGuo이 DNA의 산화의 유용한 바이오 마커로보고되었지만, 그것의 신뢰성 정량화 도전을 제기 할 수 있습니다. 여러 게시 방법이 존재하지만, 자신의 실험실에서 방법을 배포하는 연구자를 허용하는 프로토콜의 포괄적 인 개요 설명이 필요하다. 여기서 우리는 -8- 옥소 dGuo 검출 및 정량화를위한​​ 효과적인 방법을 확립하기위한 새로운 사용자를 허용 할 것이다 HPLC 기반 프로토콜의 상세한 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 캐나다 보건부 유전체학 연구 개발 이니셔티브 (GRDI)과 생명 공학에 대한 캐나다의 규제 전략 (CRSB)에 의해 투자되었다. 저자는 이해 관계의 충돌이 없습니다.

Materials

8-oxo-dGuo standard Cayman Chemical Company 89320 Inappropriately referred to as "8-hydroxy-2'-deoxy Guanosine" – see Fig. 1 and text for details
Alkaline phosphatase  Sigma-Aldrich P5931 From E.coli
Chelex 100 Sigma-Aldrich C7901 Chelates heavy metals
Desferoxamine mesylate Sigma-Aldrich D9533
dGuo standard Sigma-Aldrich D7145
Dibasic sodium phosphate Sigma-Aldrich S9390
DNA from salmon sperm Sigma-Aldrich D1626 Sodium salt
DNase I Sigma-Aldrich D4527 TypeII, from bovine pancreas
DNAzol Invitrogen 10503-27
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma-Aldrich E4884 The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 with e.g. NaOH
F12-K media ATCC 30-2004
Foetal bovine serum ATCC 30-2020
Guard column Chromatographic Specialties YBA 99S03 0204GC Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Monobasic sodium phosphate Sigma-Aldrich S9638
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-122
Phosphate buffered saline Invitrogen 15190-250
Phosphodiesterase I enzyme  Sigma-Aldrich P3243 Type II from Crotalus adamaneus venom
Teflon homogenizer Thomas Scientific 7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.
Trypsin Invitrogen 15050-065
YMC-BASIC column with bonded spherical silica Chromatographic Specialties YBA 99S03 1546WT

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Chepelev, N. L., Kennedy, D. A., Gagné, R., White, T., Long, A. S., Yauk, C. L., White, P. A. HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2’-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues. J. Vis. Exp. (102), e52697, doi:10.3791/52697 (2015).

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