Перфорированные патч-зажим записи из мышей Обонятельные сенсорные нейроны в неповрежденном нейроэпителии: Функциональный анализ нейронов выражая идентифицированного одоранта рецептор
Summary
Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.
Abstract
Анализируя физиологические реакции обонятельных сенсорных нейронов (ОСН) при стимуляции специфических лигандов важно понять основы обонятельных приводом поведения и их модуляции. Эти свойства кодирования в значительной степени зависят от начального взаимодействия между молекулами запаха и обонятельной рецептора (или) выражается в OSNs. Идентичность, специфика и лиганд спектр выраженных или являются критическими. Вероятность найти лиганд или выражены в OSN выбранной случайным образом в пределах эпителия является очень низким. Для решения этой проблемы, этот протокол использует генетически мышей отмеченных выражающие флуоресцентного белка GFP под контролем промотора, определенных ОР. OSNs находятся в тесной и организованной эпителия, выстилающих носовую полость, с соседние клетки, влияющие на их созревание и функции. Здесь мы опишем метод, чтобы изолировать нетронутыми обонятельного эпителия и записывать через патч-зажим записи свойства OSNs еxpressing определенные одоранта рецепторы. Протокол позволяет характеризовать свойства ОСН мембранные, сохраняя при этом влияние соседней ткани. Анализ результатов патч-зажим дает точную количественную оценку лиганд / или взаимодействий, трансдукции и фармакологии, свойства кодирования OSNs "и их модуляции на уровне мембраны.
Introduction
Обонятельные сенсорные нейроны (OSN) представляют собой первый шаг обонятельной восприятия. Расположенный в обонятельный эпителий, выстилающей полость носа у грызунов, они преобразуют химическую информацию пахучих веществ в потенциалы действия, отправленных через их аксонов в мозг. Чтобы лучше понять, обонятельные механизмы кодирования, необходимо охарактеризовать трансдукции и мембранные свойства OSNs. До недавнего времени большинство из методов, используемых для характеристики свойств OSNs млекопитающих не проводили на диссоциации OSNs 1-4. Процесс диссоциации использует различные механические и химические (т.е., ферменты) процессы, чтобы освободить OSNs из их среды. Эти процессы вызывают низкое число доступных ячеек для записей. Это низкое количество может быть еще более важным в случае GFP меченых клеток. Диссоциация также удаляет местной ячейки к клетке взаимодействия между OSNs и других клеток обонятельного эпителия, что может усилить survivаль и модуляции свойств OSNs. Для того, чтобы обойти процедуру диссоциации, нетронутыми препарат разработан 5.
Каждый ОСН выражает один обонятельный рецептор (OR) выбран из большого семейством генов 6. Есть ~ 1000 ОШ, выраженные в основном обонятельного эпителия у мышей. Из-за большого числа или в животных дикого типа, шансы записать OSNs экспрессирующих тот же или очень низкой. Чтобы преодолеть эти ограничения, генные целевой мышей доступны в которой все OSNs экспрессирующие идентифицированных или помечены флуоресцентного белка 7-9. Эти меченые OSNs были использованы, чтобы сделать функциональный анализ в диссоциированных препаратов 7,10,11 с недостатками, упомянутых ранее. Без изменений подготовка эпителий 5 из генетически маркированных мышей поэтому обходит эти вопросы. Это позволяет осуществлять мониторинг деятельности OSNs выражающих именно определенные ОШ в среде, максимально приближенных в VIVO, насколько это возможно. Кроме того, патч-зажим записи OSNs также позволит точный анализ мембранных свойств, трансдукции фармакологии, лиганд / или взаимодействия. Все эти темы вряд ли могут быть проанализированы с помощью внеклеточных записи. Мы использовали этот метод для контроля ответы OSNs выражающие одоранта рецепторы SR1 и MOR23 12,13. Технико-экономическое техники было подтверждено другими группами на MOR23 выражающих OSNs 14, а также на других ОШ, выражающих нейроны 15,16. Мониторинг определенного населения OSNs может привести к анализу их свойств в различных контекстах, таких как развитие 14, старение 17, отдушка индуцированной пластичность 18 и роль вариаций в последовательности одоранта рецептора запаха кодирования 15. Этот протокол, таким образом, представляет собой мощный инструмент для мониторинга функциональных свойств, определенных OSNs на уровне мембраны.
Protocol
Representative Results
Discussion
Способность этого протокола правильно контролировать свойства здоровых OSNs в значительной степени зависит от качества препарата. Таким образом, шаги рассечение являются критическими. Во-первых важно обратить внимание на качество (рН, осмолярность), оксигенации и температуры (льдом хо?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Peter Mombaerts for the generous gift of OR-GFP mice; Anne Lefranc and the CSGA animal facility for excellent animal care. Funding was provided by CNRS through an ATIP and ATIP Plus grants, by Conseil Régional de Bourgogne (FABER and PARI grants), by Université de Bourgogne (BQR program).
Materials
| heavy equipment | |||
| vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
| optics | |||
| microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
| objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4x or 10x for coarse approach to the cell; and a 40x immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW/IR/0,8/WD:3.3 MM |
| magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
| camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
| filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
| recording electrodes /system | |||
| amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
| software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
| micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/1Oth of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
| electrode puller | sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
| glass | sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
| recording chamber | warner instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
| stimulation | |||
| glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
| multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
| precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
| micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
| tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
| solutions/perfusion/chemicals | |||
| vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
| perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
| nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
| Calcium chloride di hydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
| Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
| MethylSulfoxide | Sigma-Aldrich | 47,135-6 | intracellular solution |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |
References
- Lowe, G., Gold, G. H. Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells. Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).
- Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique. J Vis Exp. (62), e3862 (2012).
- Moss, R. L., et al. Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action. Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).
- Kaur, A., Dey, S. Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons. Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).
- Ma, M., Chen, W. R. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).
- Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Bozza, T., et al. Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse. Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).
- Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb. Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).
- Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor. Cell. 117 (6), 833-846 (2004).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Grosmaitre, X., et al. SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile. J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).
- Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).
- Lam, R. S. Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23. Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).
- Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system. Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).
- Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor. J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).
- Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).
- Cadiou, H., et al. Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level. J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).
- Mombaerts, P. Axonal wiring in the mouse olfactory system. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).
- Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors. Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).
- Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. Odor response properties of rat olfactory receptor neurons. Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).
- Heydel, J. M., et al. Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events. Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).
- Pelosi, P. Perireceptor events in olfaction). J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).
- Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. 3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons. Neuron. 33, 731-739 (2002).
- Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by ‘IP(3)-odors. J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).
- Savigner, A., et al. Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin. J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).
- Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons. J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).
