مثقب تسجيل التصحيح، المشبك من الماوس العصبونات الحسية الشمية في الظهارة العصبية السليمة: التحليل الوظيفي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها إبداء الرائحة مستقبلات
Summary
Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.
Abstract
تحليل الاستجابات الفسيولوجية للخلايا العصبية الحسية الشمية (OSN) عندما حفز مع بروابط معينة أمر بالغ الأهمية لفهم أساس السلوكيات مدفوعة حاسة الشم والتشكيل الخاصة بهم. هذه الخصائص الترميز تعتمد بشكل كبير على التفاعل الأولي بين جزيئات الرائحة ومستقبلات الشم (OR) أعربت في OSNs. هوية وخصوصية ويجند الطيف من التعبير عن أو حاسمة. أعرب احتمال العثور على يجند من OR في OSN اختيارها عشوائيا داخل الظهارة منخفضة جدا. لمواجهة هذا التحدي، هذا البروتوكول يستخدم وراثيا الفئران الموسومة معربا عن GFP بروتين فلوري تحت سيطرة المروج من نسب الأرجحية محددة. وتقع OSNs في ظهارة ضيقة وتنظيم المبطنة للتجويف الأنف، مع الخلايا المجاورة تؤثر النضج وظيفة. نحن هنا تصف طريقة لعزل والظهارة الشمية سليمة وتسجيل من خلال تسجيلات التصحيح المشبك خصائص OSNs هxpressing مستقبلات الرائحة محددة. بروتوكول يسمح احد لتوصيف خصائص الغشاء OSN مع الحفاظ على تأثير الأنسجة المجاورة. تحليل نتائج التصحيح، المشبك غلة الكمي الدقيق ليجند / أو التفاعلات، ومسارات نقل والصيدلة، والترميز خصائص OSNs 'والتشكيل على مستوى الغشاء.
Introduction
الخلايا العصبية الحسية الشمية (OSN) تمثل الخطوة الأولى للإدراك حاسة الشم. تقع في الظهارة الشمية بطانة التجويف الأنفي لدى القوارض، وتحويل المعلومات الكيميائية للعطر في إمكانات العمل التي يتم إرسالها عبر محور عصبي على الدماغ. لفهم أفضل للآليات الترميز حاسة الشم، فمن الضروري أن تميز تنبيغ وغشاء خصائص OSNs. حتى وقت قريب، نفذت معظم التقنيات المستخدمة لوصف خصائص OSNs الثدييات خارجا على فصل OSNs 1-4. تستخدم عملية التفكك المختلفة (أي الإنزيمات) العمليات الميكانيكية والكيميائية لتحرير OSNs من بيئتهم. هذه العمليات لحث على عدد منخفض من خلايا متاحة للتسجيلات. هذا العدد المنخفض يمكن أن يكون أكثر أهمية في حالة الخلايا GFP المسمى. التفكك أيضا إلى إزالة الخلية الى خلية التفاعلات المحلية بين OSNs وخلايا أخرى من الظهارة الشمية التي قد تعزز survivالقاعدة وتعديل خصائص OSNs. من أجل تجاوز الإجراء التفكك، تم وضع إعداد سليمة 5.
كل OSN يعبر عن مستقبلات الشم واحدة (OR) مختارة من عائلة متعددة الجينات كبيرة 6. هناك ~ 1000 نسب الأرجحية التي أعرب عنها في الظهارة الشمية الرئيسية في الماوس. نظرا لوجود عدد كبير من الحيوانات أو في نوع البرية، وفرص لتسجيل OSNs التعبير عن نفسه أو منخفضة جدا. للتغلب على هذه القيود، هي الجينات المستهدفة الفئران المتاحة فيها جميع OSNs التعبير عن الهوية أو وصفت مع البروتين الفلوري 7-9. واستخدمت هذه OSNs المسمى للقيام تحليل وظيفي في الأعمال التحضيرية فصلها 7،10،11 مع العيوب المذكورة في وقت سابق. لذا لإعداد ظهارة سليمة 5 من الفئران وصفت وراثيا تلتف هذه القضايا. لأنها تتيح رصد نشاط OSNs معربا عن نسب الأرجحية محددة بدقة في بيئة أقرب إلى في السادسفو وقت ممكن. الى جانب ذلك، تسجيلات التصحيح المشبك من OSNs تسمح أيضا تحليل دقيق لخصائص الغشاء، تنبيغ مسار الصيدلة، يجند / أو التفاعلات. بالكاد يمكن تحليل كل هذه المواضيع باستخدام التسجيلات خارج الخلية. استخدمنا هذه التقنية لرصد ردود OSNs التعبير عن مستقبلات الرائحة SR1 وMOR23 12،13. تم تأكيد جدوى هذه التقنية من قبل مجموعات أخرى على MOR23 معربا عن OSNs 14 فضلا عن نسب الأرجحية الأخرى معربا عن الخلايا العصبية 15،16. رصد مجموعة محددة من OSNs يمكن أن يؤدي إلى تحليل خصائصها في العديد من السياقات المختلفة مثل التنمية 14، والشيخوخة 17، الرائحة التي يسببها اللدونة 18، ودور الاختلافات في تسلسل مستقبلات الرائحة في رائحة الترميز 15. وبالتالي يتيح هذا البروتوكول أداة قوية لرصد الخصائص الفنية للOSNs المعرفة على مستوى الغشاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
قدرة هذا البروتوكول لرصد خصائص OSNs صحية بشكل صحيح تعتمد بشكل كبير على جودة إعداد. ولذلك، فإن الخطوات تشريح حاسمة. أولا من المهم جدا أن تولي اهتماما لنوعية (الرقم الهيدروجيني، الأسمولية)، الأوكسجين ودرجة الحرارة (المثلج ولكن ليس المجمدة) من المتوسط تشريح. ثانيا، الت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Peter Mombaerts for the generous gift of OR-GFP mice; Anne Lefranc and the CSGA animal facility for excellent animal care. Funding was provided by CNRS through an ATIP and ATIP Plus grants, by Conseil Régional de Bourgogne (FABER and PARI grants), by Université de Bourgogne (BQR program).
Materials
| heavy equipment | |||
| vibration table with Faraday cage | TMC | 63-500 SERIES | required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment |
| optics | |||
| microscope | Olympus | BX51WI | upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user's preference |
| objectives | Olympus | LUMPLFL40XW | at least 2 objectives required: a 4x or 10x for coarse approach to the cell; and a 40x immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW/IR/0,8/WD:3.3 MM |
| magnifier | Olympus | U-TVCAC | ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode |
| camera | Olympus | DP72 | a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary |
| filters | Olympus/Chroma | depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m | |
| recording electrodes /system | |||
| amplifier | HEKA | EPC10 USB | monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer |
| software | HEKA | Patchmaster | controls the amplifier during the experiment |
| micromanipulator | Sutter | MP225 | precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/1Oth of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift |
| electrode puller | sutter | P97 | with a FT345-B wide trough filament; to prepare recording pipets of about 2µm diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution |
| glass | sutter | BF120-69-10 | in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets |
| recording chamber | warner instruments | RC-26G | a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used. |
| stimulation | |||
| glass | WPI | TW100F-4 | attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes |
| multibarrel puller | MDI | PMP-107-Z | by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels |
| precision pressure injector | Toohey Company | P/N T25-1-900 Single Channel | this precision pressure injector controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V TTLs |
| micromanipulator | Narishige | YOU-1 | a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site |
| tubings | N/A | tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette | |
| solutions/perfusion/chemicals | |||
| vacuum pump | gardner denver | 300 series | a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps |
| perfusion system | N/A | N/A | gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber |
| nystatin | Sigma-Aldrich | N3503 | mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp |
| DIMETHYL SULFOXIDE | Sigma-Aldrich | D5879 | used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | intracellular/extracellular solution |
| Calcium chloride di hydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S9638 | extracellular solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O) | Sigma-Aldrich | 63140 | extracellular solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | extracellular solution |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | extracellular solution |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | E3889 | internal solution |
| Potassium hydroxyde | Sigma-Aldrich | P1767 | internal solution |
| MethylSulfoxide | Sigma-Aldrich | 47,135-6 | intracellular solution |
| Hepes-Na | Sigma-Aldrich | H7006 | intracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | intracellular solution |
References
- Lowe, G., Gold, G. H. Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells. Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).
- Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique. J Vis Exp. (62), e3862 (2012).
- Moss, R. L., et al. Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action. Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).
- Kaur, A., Dey, S. Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons. Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).
- Ma, M., Chen, W. R. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).
- Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Bozza, T., et al. Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse. Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).
- Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb. Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).
- Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor. Cell. 117 (6), 833-846 (2004).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Grosmaitre, X., et al. SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile. J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).
- Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).
- Lam, R. S. Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23. Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).
- Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system. Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).
- Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor. J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).
- Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).
- Cadiou, H., et al. Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level. J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).
- Mombaerts, P. Axonal wiring in the mouse olfactory system. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).
- Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors. Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).
- Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. Odor response properties of rat olfactory receptor neurons. Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).
- Heydel, J. M., et al. Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events. Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).
- Pelosi, P. Perireceptor events in olfaction). J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).
- Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. 3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons. Neuron. 33, 731-739 (2002).
- Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by ‘IP(3)-odors. J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).
- Savigner, A., et al. Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin. J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).
- Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons. J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).
