المدى الطويل حيوي داخلي Multiphoton المجهر التصوير من الخلايا المناعية في السليمة والمريضة الكبد عن طريق الفئران CXCR6.Gfp مراسل
Summary
Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.
Abstract
التهاب الكبد كرد فعل على الإصابة هي عملية ديناميكية للغاية تنطوي على تسلل فرعية متميزة من الكريات البيض بما في ذلك حيدات، العدلات، T مجموعات فرعية الخلايا، والخلايا B، القاتلة الطبيعية (NK) والخلايا NKT. intravital المجهري للكبد لرصد هجرة الخلايا المناعية هو تحديا من نوع خاص نظرا لمتطلبات عالية فيما يتعلق إعداد العينات وتثبيت، القرار البصرية وبقاء الحيوان على المدى الطويل. ومع ذلك، ويمكن أن ديناميات العمليات الالتهابية وكذلك دراسات التفاعل الخلوية توفير المعلومات الهامة لفهم أفضل للبدء، تقدم وتراجع أمراض الكبد التهابات. لذلك، أنشئ طريقة حساسة للغاية ويمكن الاعتماد عليها لدراسة الهجرة وخلية خلية التفاعلات الخلايا المناعية المختلفة في الكبد الماوس على مدى فترات طويلة (حوالي 6 ساعات) من خلال حيوي داخلي ثنائي الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر (TPLSM) في تركيبة مع العناية المركزة الرصد.
والأنف والحنجرة "> طريقة المقدمة يتضمن إعداد لطيف وتثبيت مستقر الكبد مع الحد الأدنى من اضطراب في الجهاز، التصوير حيوي داخلي المدى الطويل يستخدم متعدد الألوان multiphoton المجهري مع عمليا أي photobleaching من أو التأثيرات الضوئية على مدى فترة زمنية تصل إلى 6 ساعات، مما يتيح تتبع من مجموعات فرعية الكريات البيض محددة؛ وشروط التصوير مستقرة بسبب مراقبة واسعة من الماوس المعلمات الحيوية واستقرار الدورة الدموية، درجة الحرارة وتبادل الغازات.للتحقيق في الهجرة اللمفاويات على التهاب الكبد CXCR6.gfp الضربة القاضية في الفئران تعرضوا للتصوير الكبد حيوي داخلي في ظل ظروف خط الأساس وبعد تلف الكبد الحاد والمزمن الناجم عن حقن داخل الصفاق (ق) من رابع كلوريد الكربون (لجنة علم المناخ 4).
CXCR6 هو مستقبلات chemokine أعرب عن الخلايا الليمفاوية، وذلك أساسا على الطبيعية القاتل T (NKT) – القاتلة الطبيعية (NK) – ومجموعات فرعية من الخلايا الليمفاوية T مثل خلايا CD4 T ولكن أيضا associ المخاطيةated ثابتة (مائت) خلايا تي 1. في أعقاب نمط الهجرة وتحديد المواقع من CXCR6.gfp + الخلايا المناعية يسمح نظرة مفصلة في سلوكهم تغير على اصابة الكبد، وبالتالي مشاركتهم المحتملة في تطور المرض.
Introduction
لقد كان التصور من الخلايا والوظائف الخلوية في أجهزة كاملة أو الكائنات حتى كلها ذات أهمية كبيرة لأكثر من 50 عاما، بما في ذلك كل أجزاء الجسم 2. لذلك، فإن بعض الدراسات المبكرة استخدمت بالفعل التصوير حيوي داخلي في الكبد 3،4. ومع ذلك، توجد العديد من القيود على آخر المستجدات المتعلقة المدى الطويل عالية الدقة مستقر التصوير من أنسجة الكبد.
بسبب موقف التشريحي للكبد في اتصال وثيق مع الحجاب الحاجز والجهاز الهضمي 5، والمشكلة الأكثر شيوعا للتصوير حيوي داخلي المجهري هي الحركة بسبب التنفس، وإلى حد أقل، تحوي من الأمعاء 6. وبالمقارنة مع الأجهزة الصلبة الأخرى، وجراحة الكبد هي تحديا من نوع خاص. نظرا لهيكل الاوعية الدموية الدقيقة كثيفة، يمكن التلاعب الجراحية تؤدي إلى آفات النزفية واسعة النطاق، وضعف دوران الأوعية الدقيقة 7، وكذلك تفعيل المقيمين طخلايا مناعية مثل خلايا كوبفر 8. ولذلك، التثبيت الميكانيكي للأنسجة كما نشرت في أماكن أخرى 6،9 من المحتمل أن تتداخل مع التصوير intravital المجهري.
في كبد صحي، 10-15٪ من حجم الدم الكلي يكمن داخل الأوعية الدموية والكبد، والجهاز يستقبل حوالي 25٪ من النتاج القلبي العام 10، مما يجعل الجهاز عرضة للتغيرات في الدورة الدموية (على سبيل المثال، وتقلبات ضغط الدم ). ولذلك، فإن اضطرابات في تدفق الدم الكبدي بسبب مثل إجهاد القص، والتشرد، والإصابة التي كتبها معالجة الأنسجة المفرط أو تداول مركزية تؤدي إلى تغيرات مصطنعة في الكريات البيض سلوك الهجرة، الأوكسجين الكبد وضعف، وبالتالي المزيد من تلف الكبد، مما يؤثر على الكبد الاستجابات المناعية وكذلك كما الحفاظ على الجهاز والوقت حياة الشامل للحيوان.
واستندت الدراسات المجهرية في وقت مبكر على ميل epifluorescence حيوي داخليcroscopy، ولكن العديد من المعوقات الفنية مثل تبيض الصورة وعمق الاختراق المنخفض تحد من استخدام هذه التقنية لتصوير الكبد على المدى الطويل 4،11،12. مع تطور المجهر multiphoton في 1990s، تم حل القيود المفروضة على الصورة تبيض أو عمق الاختراق بشكل رئيسي، كما كان هذا الأسلوب الجديد قادر من الناحية الفنية لإجراء دراسات التصوير في تقريبا جميع الأجهزة تحت مواقف الحياة الحقيقية 13-15. ومع ذلك، كانت التحديات الرئيسية المتبقية فيما يتعلق التصوير الكبد: حركات التنفس، وتألق ذاتي من أنسجة الكبد، وتأمين تدفق الدم دون تغيير في الجيوب الكبدية، والتصوير مستقر وخاصة لفترات أطول من عدة ساعة 16.
على الرغم من أن العديد من الدراسات تناولت وظيفة والهجرة من مختلف الكريات البيض في الكبد 17، على سبيل المثال، NKT خلايا 18-20، وخلايا T 21،22، 23،24 الضامة الكبد أو العدلات 25، المدى الطويل multiphoton ملم يتم بعد إنشاء التصوير icroscopy بنجاح، وهي مهمة أكثر صعوبة في الحيوانات مع مرض الكبد الحاد أو المزمن بسبب الأضرار الموجودة وبالتالي ارتفاع قابلية لمزيد من الضرر 26. ومع ذلك، ومراقبة سلوك الهجرة وظيفة الخلوية من الكريات البيض في الكبد في الوقت الحقيقي يتيح رؤى جديدة في دورها معين في التوازن الكبد ومرض 27.
يتم التعبير عن CXCR6 مستقبلات chemokine على عدة مجموعات فرعية لمفاوية، بما في ذلك القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا، والخلايا NKT وبعض السكان الخلية T 18،28. وقد أشارت الدراسات السابقة في الفئران التي CXCR6 وCXCL16 يجند لها وما شابه ذلك قد السيطرة على الدوريات الخلايا NKT على الجيوب الكبد خلال التوازن. ونتيجة لذلك، وقد وصفت استخدام الفئران CXCR6.gfp (يحمل في المغلوب من البروتين الفلوري الأخضر [GFP] في موضع CXCR6) للتحقيق في الهجرة من الخلايا الليمفاوية في مختلف أجهزة مثل الدماغ 29وكذلك الكبد 18،20، والتي تبين زيادة تسلل خلايا CXCR6.gfp على الالتهاب.
مع أسلوب المقدمة في هذه الدراسة كان من الممكن أن تتبع هذه العمليات على مدى فترة طويلة من الزمن في ظل ظروف مستقرة. يسمح الإجراء multiphoton حيوي داخلي يستند التصوير التي كان استنساخه للغاية مع الحد الأدنى من اضطراب الحيوان والجهاز. الأمثل لبقاء الحيوان على المدى الطويل من خلال رصد واسعة تليها مراقبة وثيقة من التنفس والدورة الدموية. ومرنة للغاية وسهلة تعتمد أيضا على أجهزة متني أخرى مثل الكلى أو الطحال.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكان الهدف من دراستنا لتطوير طريقة موحدة للغاية، ومستقرة وقابلة للتكرار للتصوير TPLSM حيوي داخلي في الكبد. وقد أعطى التصوير حيوي داخلي بشكل عام معلومات قيمة حول سلوك الخلوية في ظل ظروف الحياة الحقيقية بعد صاروخ موجه وتفاعل السكان الكريات البيض مختلفة في التنمية، والت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Central Animal facility of the University Hospital Aachen for technical support. This work was supported by the German Research Foundation (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) and by the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen. This work was further supported by the Core Facility ”Two-Photon Imaging”, a Core Facility of the Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Aachen within the Faculty of Medicine at RWTH Aachen University.
Materials
| Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
| Fentanyl | Rotex Medica | charge: 30819 | |
| Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
| Glucose 5% | Braun | ||
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ketamin 10% | ceva | Charge: 36217/09 | |
| Xylazin 2% | medistar | Charge: 04-03-9338/23 | |
| Consumable supplies | |||
| 20ml Syringe | BD Plastipak | ||
| 250ml Erlenmeyer flask | Schott Duran | 21 226 36 | |
| 25mL Beaker 2x | Schott Duran | 50-1150 | |
| 2ml syringe | BD Plastipak | ||
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | V7980 | |
| Agarose | commercially available | ||
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit | Fine Science Tools Inc. | 18010-00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Cover Slip 24x50mm | ROTH | 1871 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Feather disposable scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Fine Bore Polythene Tubing 0,58mm ID | Smiths medical | 800/100/200 | |
| Histoacryl | Braun | 1050052 | 5x 0,5ml |
| Leukoplast | BSN Medical Inc. | ||
| Microscope Slides | ROTH | 1879 | |
| Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G x 1 | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G x 1 | B. Braun | 4657705 | |
| Tissue paper | commercially available | ||
| Surgical Instruments | |||
| Amalgam burnisher 3PL | Gatz | 0110? | |
| Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 | Storz&Klein | S-01134 | |
| Dumont No.7 forceps | Fine Science Tools Inc. | 91197-00 | |
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight x2 | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Heidemann spatula HD2 | Stoma | 2030.00 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| ECG Trigger Unit | Rapid Biomedical | 3000003686 | |
| MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer | AD Instruments | ||
| Minivent Typ 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
| Multiphoton microscope Trimscope I | LaVision | ||
| Perfusor Compact | B. Braun | ||
| PowerLab 8/30 8 channel recorder | AD Instruments | PL3508 | |
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Temperature sensor | comercially available | ||
| Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box | Life Imaging Services |
References
- Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).
- Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
- Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10 (11), 955 (1969).
- Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).
- Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, S525-S527 (2000).
- Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).
- Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).
- Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).
- Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).
- Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).
- Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).
- Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).
- Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).
- Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver–challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).
- McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).
- Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3 (4), (2005).
- Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).
- Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).
- Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).
- Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
- Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).
- Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6 (3), e1000805 (2010).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
- Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).
- Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).
- Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).
- Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
- Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).
- Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).
- Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).
- Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).
- Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).
- Syn, W. -. K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).
- McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).
- Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
- Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).
- Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4 (3), e4693 (2009).
