التباين التصوير في أجنة الفئران عن طريق الموجات فوق الصوتية عالية التردد
Summary
هنا، نقدم بروتوكول لحقن الموجات فوق الصوتية وكلاء microbubble التباين في المعيشة، معزولة في وقت متأخر من الحمل أجنة الفئران المرحلة. تمكن هذه الطريقة دراسة المعلمات نضح والواسمات الجزيئية الأوعية الدموية داخل الجنين باستخدام عالية التردد التصوير بالموجات فوق الصوتية على النقيض محسنة.
Abstract
Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or αvβ3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.
Introduction
التصوير بالموجات فوق الصوتية على النقيض محسنة يجعل من استخدام وكلاء microbubble خلافا لتصور وتميز البيئة الأوعية الدموية. هذه العوامل تمكن من إجراء تقييم موسع للدوران الأوعية الدقيقة، الأوعية الدموية وظيفة القلب والأوعية الدموية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تعديل سطح الفقاعة يؤدي إلى microbubble المستهدف ملزمة لالمؤشرات الحيوية البطانية، كما هو موضح في التطبيقات قبل السريرية من الأوعية الدموية، وتصلب الشرايين والتهاب 1،2 مما يجعل من التصوير بالموجات فوق الصوتية الجزيئي للأحداث الأوعية الدموية الممكنة. بالتالي يمكن استخدامها على النقيض تعزيز الموجات فوق الصوتية لتحديد بيئات معقدة ومتنوعة التي تؤثر على الدول السليمة والمريضة الأوعية الدموية 3-5.
في عدد من السنوات الماضية، امتد الاهتمام فائدة التصوير microbubble إلى تنوعا نموذج الفأر الجنين. كنموذج للتنمية الثدييات، وإدخال microbubbles في الأوعية الدموية الجنينية يعزز الفسيولوجية دراسة الدورة الدموية تطوير (على سبيل المثال، وتدفق الدم، خرج القلب) وفي حالات المعدلة وراثيا ونماذج الماوس متحولة المستهدفة من أمراض القلب 6،7، قد تسفر نظرة ثاقبة كيف العوامل الوراثية تغيير وظيفة القلب والأوعية الدموية. في الواقع، ويحلل 2D الكمي والنوعي لالجنينية الأوعية الدموية في الدماغ وقد تم بالفعل تحقيق 8. وعلاوة على ذلك، يقدم جنين الفأر نموذجا ممتازا لدراسة الربط من microbubbles تستهدف علامات الأوعية الدموية في الجسم الحي. Bartelle وآخرون 9، على سبيل المثال، أدخلت microbubbles أفيدين إلى الجنين البطينين في القلب لتقييم استهدفت ملزمة في Biotag-البيرة الأجنة وراثيا ودراسة علم التشريح الأوعية الدموية. توليد نماذج الماوس متخالف ومتماثل يمكن أيضا أن تستخدم كبديل للدراسات نموذج الورم تهدف إلى تحديد طبيعة كمية الموجات فوق الصوتية الجزيئي – معيارا هاما في ترجمة هذه التقنية إلى العيادة.
<p clالحمار = "jove_content"> يتم في معظم الأحيان أدخلت Microbubbles إلى الدورة الدموية الجنينية عن طريق الحقن داخل القلب في الأجنة واحدة يتعرض من خلال فتح البطن 8-10. وفي الحقن داخل الرحم، ومع ذلك، تواجه عددا من التحديات. وتشمل هذه التوجيهات الحقن، والحاجة لمواجهة الحركة في الأم والجنين exteriorized، والحفاظ على حيوية الدورة الدموية في الأم والأجنة exteriorized، ومعالجة الآثار طويلة الأجل للتخدير والمضاعفات الناجمة عن النزيف 11. لذلك، كان الهدف من التحقيق لتطوير تقنية لحقن microbubbles في المعيشة عزل الأجنة في مرحلة متأخرة 12. يوفر هذا الخيار مزيدا من الحرية من حيث السيطرة الحقن وتحديد المواقع، واستنساخ الطائرة التصوير دون إعاقة، وتحليل الصور مبسط والكمي.في هذه الدراسة، فإننا الخطوط العريضة لإجراء جديدا لحقن microbubbles في العيش أجنة الفئران FOص أغراض دراسة السلوك الحركي microbubble ودراسة microbubble ملزمة لعلامات سطح البطانية الذاتية المستهدفة. يستخدم غير الخطية التصوير بالموجات فوق الصوتية معين المقابل لقياس عدد من المعلمات نضح الأساسية بما في ذلك تعزيز الذروة (PE)، ويغسل في معدل والوقت إلى الذروة (TTP) في الأجنة E17.5 معزولة. نحن أيضا تدليل على صحة الجنين نموذج لتقييم طبيعة كمية الموجات فوق الصوتية الجزيئي في خسارة endoglin الجنينية من نموذج الفأر وظيفة المعدلة وراثيا، حيث endoglin هو هدف ذات الصلة سريريا بسبب التعبير عنها ارتفاع في خلايا بطانة الأوعية الدموية في مواقع الأوعية الدموية النشطة 13 . يتم تقييم التصاق (MB E)، التي تستهدف endoglin نمط إسوي الفئران مفتش 2 التحكم (MB C) وتشتته (MB U) microbubbles في endoglin متخالف (المهندس +/-) وendoglin متماثل (المهندس + / +) معربا عن أجنة. تحليل بيندي المستهدفةنانوغرام يكشف عن أن الموجات فوق الصوتية الجزيئي قادر على التمييز بين الأنماط الجينية endoglin والمتعلقة كثافة مستقبلات إلى مستويات الموجات فوق الصوتية الجزيئية للقياس الكمي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم حقن عوامل التباين الموجات فوق الصوتية في مرحلة متأخرة من الحمل الأجنة الماوس وعلى النقيض من الصور غير الخطية تم الحصول عليها لقياس المعلمات نضح وهادفة microbubble ملزمة. كان التصوير الناجح لmicrobubbles داخل الأوعية الدموية الجنينية يعتمد على عدد من العوامل، أولها بقاء الج?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Terry Fox Program of the National Cancer Institute of Canada.
Materials
| Reagents | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Antibodies (biotinylated, eBioscience) | Antibody choice depends on the experiment | ||
| rat isotype IgG2 control | eBioscience | 13-4321-85 | This antibody/microbubble combination is often required as experimental control |
| biotin anti-mouse CD309 | eBioscience | 13-5821-85 | |
| Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin | In house hybridoma | Outside antibodies may also be appropriate: we have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past | |
| Distilled water | |||
| Embryo media | |||
| 500 mL Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose | Sigma | D5796 | |
| 50 mL Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | lot # 7592456 |
| Hepes | Gibco | 15630 | 5mL, 1M |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mL, 10,000 units Pen., 10,000 ug Strep |
| Ethanol, 70% | |||
| Ice | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | 76240 | 4% |
| Phosphate Buffered Saline [1x] | Sigma | D8537 | 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride |
| Pregnant mouse, CD-1 | Charles River Laboratories Inc. | ||
| 0.9% sodium chloride (saline) | Hospira | 0409-7984-11 | |
| Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted | MicroMarker; VisualSonics Inc. | ||
| Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) | CSP Medical | 133-1009 | |
| Equipment | |||
| Cell culture plates (4) : 100×20 mm | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| Cell culture plates (12) : 60×15 mm | Sigma | D8054 | |
| Centrifuge | Sorvall Legend RT centrifuge | ||
| Conical tubes, 50 mL BD Falcon | VWR | 21008-938 | |
| Diluent | Beckman Coulter | Isoton II Diluent, 8448011 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Forceps (2), Dumont SS (0.10×0.06 mm) | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Forceps, splinter | VWR | 25601-134 | |
| Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) | VWR | 89000-216 | |
| Glass capillaries, 1×90 mm GD-1 with filament | Narishige | GD-1 | |
| Glass needle puller | Narishige | PN-30 | |
| Gloves | Ansell | 4002 | |
| Gross anatomy probe | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Hot plate | VWR | 89090-994 | |
| Ice bucket | Cole Parmer | RK 06274-01 | |
| Imaging Platform | VisualSonics Inc. | Integrated Rail System | |
| Light source, fiber-optic | Fisher Scientific | 12-562-36 | Ideally has adjustable arms |
| Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread | Cole Parmer | 45500-30 | |
| Micro-ultrasound system, high-frequency | VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Needles, 21 gauge (1”) | VWR | 305165 | |
| Particle size analyzer | Beckman Coulter | Multisizer 3 Coulter Counter | |
| Perforated spoon (Moria) | Fine Science Tools | MC 17 10373-17 | |
| Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Pipettors [2-20 uL, 20-200uL, 100-1000uL] | Eppendorf | Research Plus adjustable 3120000038; 3120000054; 3120000062 | |
| Pipettor tips [2-200uL, 50-1000uL] | Eppendorf | epT.I.P.S. 22491334; 022491351 | |
| Scissors | |||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Tubing, Tygon laboratory 1/32×3/32” | VWR | 63010-007 | |
| Wooden applicator stick (swab, cotton head) | VWR | CA89031-270 | |
| Surgical microscope 5-8x magnification | Fisher Scientific | Steromaster | |
| Syringes, 1 mL Normject | Fisher | 14-817-25 | |
| Syringes (10), 30 mL | VWR | CA64000-041 | |
| Syringe infusion pump | Bio-lynx | NE-1000 | |
| Thermometer, -20-110oC | VWR | 89095-598 | |
| Timer | VWR | 33501-418 | |
| Tubes, Eppendorf | VWR | 20170-577 | |
| Tube racks (3) | VWR | 82024-462 | |
| Ultrasound transducer, 20 MHz | VisualSonics Inc. | MS250 | |
| Vannas-Tubingen, angled up | Fine Science Tools | 15005-08 |
References
- Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48 (2), 92-97 (2009).
- Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47 (8), 875-882 (2009).
- Cosgrove, D., Lassau, N. Imaging of perfusion using ultrasound. European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging. 37 (S1), 65 (2010).
- Williams, R., et al. Dynamic microbubble contrast-enhanced US to measure tumor response to targeted therapy: A proposed clinical protocol with results from renal cell carcinoma patients receiving antiangiogenic therapy. Radiology. 260 (2), 581 (2011).
- Burns, P. N., Wilson, S. R. Focal liver masses: Enhancement patterns on contrast-enhanced Images – Concordance of US scans with CT scans and MR images. Radiology. 242 (1), 162 (2006).
- Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. 40 MHz doppler characterization of umbilical and dorsal aortic Blood flow in the early mouse embryo. Ultrasound. In Medicine And Biology. 26 (8), 1275-1283 (2000).
- Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. Spatial velocity profile in mouse embryonic aorta and doppler-derived volumetric flow: A preliminary model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H908-H916 (2002).
- Aristizábal, O., Williamson, R., Turnbull, D. H. . 12A-4 in vivo 3D contrast-enhanced imaging of the embryonic mouse vasculature. Paper presented at Ultrasonics Symposium. , (2007).
- Bartelle, B. B., et al. Novel genetic approach for in vivo vascular imaging in mice. Circ.Res. 110 (7), 938-947 (2012).
- Endoh, M., et al. Fetal gene transfer by intrauterine injection with microbubble-enhanced ultrasound. Molecular Therapy. 5 (5), 501-508 (2002).
- Yamada, M., Hatta, T., Otani, H. Mouse exo utero development system: Protocol and troubleshooting. Congenital Anomalies. 48 (4), 183-187 (2008).
- Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Hudson, J. M., Purin, M. C., Foster, F. S. VEGFR2-targeted molecular imaging in the mouse embryo: An alternative to the tumor model. Ultrasound in medicine and biology. 40 (2), 389-399 (2014).
- Paauwe, M., Dijke, t. e. n., P, L. J. A. C., Hawinkels, Endoglin for tumor imaging and targeted cancer therapy. Expert Opinion On Therapeutic Targets. 17 (4), 421-435 (2013).
- Bourdeau, A., Faughnan, M. E., Letarte, M. Endoglin-deficient mice, a unique model to study hereditary hemorrhagic telangiectasia. Trends Cardiovasc. Med. 10 (7), 279-285 (2000).
- Whiteley, K. J., Adamson, S. L., Pfarrer, C. D. Vascular corrosion casting of the uteroplacental and fetoplacental vasculature in mice. Placenta And Trophoblast: Methods And Protocols. 121 (121), 371-392 (2006).
- Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47 (2), 103-10 (2006).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. 85, (2014).
- Willmann, J. K., et al. Targeted contrast-enhanced ultrasound imaging of tumor angiogenesis with contrast microbubbles conjugated to integrin-binding knottin peptides. The Journal of Nuclear Medicine. 51 (3), 433-440 (2010).
- Deshpande, N., Ren, Y., Foygel, K., Rosenberg, J., Willmann, J. K. Tumor angiogenic marker expression levels during tumor growth: Longitudinal assessment with molecularly targeted microbubbles and US imaging. Radiology. 258 (3), 804-811 (2011).
- Lyshchik, A., et al. Molecular imaging of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression using targeted contrast-enhanced high-frequency ultrasonography. Journal Of Ultrasound In Medicine. 26 (11), 1575-1586 (2007).
- Jerkic, M., et al. Endoglin regulates nitric oxide-dependent vasodilatation. The FASEB Journal. 18 (3), 609-611 (2004).
- Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Lee, J. J. Y., et al. . Contrast-Enhanced Molecular Ultrasound Differentiates Endoglin Genotypes in Mouse Embryos. , (2014).
- Adamson, S. L., Lu, Y., Whiteley, K. J., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250, 358-35 (2002).
- Needles, A., et al. Nonlinear contrast imaging with an array-based micro-ultrasound system. Ultrasound. Medicine Biology. 36 (12), 2097 (2010).
- Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
- Shalaby, F., Rossant, J., Yamaguchi, T. P., et al. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature. 376, 62-66 (1995).
- Kwee, L., Baldwin, H. S., Shen, H. M., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121, (1995).
- Mercurio, A. M. Lessons from the α2 integrin knockout mouse. The American journal of pathology. , 161-163 (2002).
- Hodivala-Dilke, K. αvβ3 integrin and angiogenesis: a moody integrin in a changing environment. Curr Opin Cell Biol. 20, 514-519 (2008).
- Pysz, M. A., Gambhir, S. S., Willmann, J. K. Molecular imaging: current status and emerging strategies. Clinical radiology. 65, 500-516 (2010).
- Cybulsky, M. I., Iiyama, K., Li, H., et al. A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J Clin Invest. 107, 1255-1262 (2001).
- Xu, H., Gonzalo, J. A., St Pierre, ., Y, , et al. Leukocytosis and resistance to septic shock in intercellular adhesion molecule 1-deficient mice. J Exp Med. 180, 95-109 (1994).
- Gerwin, N., Gonzalo, J. A., Lloyd, C., et al. Prolonged eosinophil accumulation in allergic lung interstitium of ICAM-2-deficient mice results in extended hyperresponsiveness. Immunity. 10, 9-19 (1999).
- Johnson, R. C., Mayadas, T. N., Frenette, P. S., et al. Blood cell dynamics in P-selectin-deficient mice. Blood. 86, 1106-1114 (1995).
- Corrigan, N., Brazil, D., McAuliffe, F. High-frequency ultrasound assessment of the murine heart from embryo through to juvenile. Reproductive Sciences. 17 (2), 147-14 (2010).
- Turnbull, D. H., Bloomfield, T. S., Baldwin, H. S., Foster, F. S., Joyner, A. L. Ultrasound backscatter microscope analysis of early mouse embryonic brain development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 2239-2243 (1995).
- Greco, A., Mancini, M. L., Gargiulo, S., et al. Ultrasound Biomicroscopy in Small Animal Research: Applications in Molecular and Preclinical Imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).
- Pysz, M. A., Guracar, I., Foygel, K., Tian, L., Willmann, J. K. Quantitative assessment of tumor angiogenesis using real-time motion-compensated contrast-enhanced ultrasound imaging. Angiogenesis. 15, 433-442 (2012).
- Larina, I. V., et al. Live imaging of blood flow in mammalian embryos using doppler swept-source optical coherence tomography. J.Biomed.Opt. 13 (6), 060506-06 (2008).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. . Live imaging of mouse embryos. 4 (4), 104-10 (2011).
- Teichert, A., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene expression during murine embryogenesis. Commencement of expression in the embryo occurs with the establishment of a unidirectional circulatory system. Circulation Research. 103 (1), 24-33 (2008).
- Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-dimensional analysis of vascular development in the mouse embryo. PLoS One. 3 (8), (2008).
