Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em> Escherichia coli</em

1. Costruzione di vettori di espressione Usa PCR Infusion clonazione di costruire fino a 96 plasmidi di espressione in parallelo con i vettori pOPINE-3C-GFP e Popin-N-GFP che aggiungono sia scindibili fusioni GFP-His6 C-terminale o N-terminale alle sequenze 13 rispettivamente. Nota: La scelta del vettore è dettata dalla topologia della proteina poiché la GFP deve essere espresso nel citosol, quindi per una proteina con un citosolica N-terminale e C-terminale extracellulare useremo Popin-N-GFP e un extracellulare N-terminale e citosolica C-terminale in useremmo pOPINE-3C-GFP. Se i due termini sono citosolico useremmo pOPINE-3C-GFP meno che non vi sia ragione funzionale non per contrassegnare il C-terminale. Amplificare le sequenze di DNA che codificano per le proteine ​​di membrana con primer che incorporano le seguenti estensioni indicate: pOPINE-3C-GFP (fondo Forward – AGGAGATATACCATG; Primer Reverse – CAGAACTTCCAGTTT) e Popin-N-GFP (fondo Forward – AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG; Reverse Primer – ATGGTCTAGAAAGCTTTA). Analizzare la reazione di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio. Una volta prodotti puliti di PCR sono stati ottenuti, aggiungere 5 U DpnI a ciascun bene (fare in 5 ml di tampone di reazione 1x DpnI). Purificare i prodotti PCR utilizzando sfere magnetiche in un formato a 96 pozzetti. Nota: DpnI viene aggiunto per rimuovere il modello vettoriale; questo passaggio non è necessario se il DNA genomico è usato come template. Aggiungere 1 ml (100 ng) del corrispondente vettore linearizzato a ciascun pozzetto di una piastra PCR. Usando una pipetta multicanale add x ml di purificato PCR inserire nei rispettivi pozzetti della piastra PCR. Assicurarsi che tutti i prodotti sono nell'intervallo 10-250 ng. Aggiungere (9-x) microlitri di acqua al pozzo e trasferire il tutto 10 microlitri di una provetta contenente secco-down in fusione reagente. Lasciare agire per 30 sec. Mescolare contenuti brevemente pipettando su e giù. Trasferimentole reazioni di nuovo alla piastra PCR originale e la guarnizione. Incubare per 30 minuti a 42 ° C in un termociclatore. Trasferire immediatamente le reazioni in ghiaccio quando la reazione è completa e aggiungere 40 ml di TE (Tris 10 mM, pH 8,0, 1 mM EDTA). Congelare immediatamente o trasformare in cellule competenti. Per la trasformazione, usare 3 ml di reazione diluito per 50 microlitri aliquota di alta competenza (> 5 x 10 9 trasformanti / mg) competente E. coli. Aggiungere 1 ml di LB agar integrato con 50 mg / ml carbenicillina per pozzetto di una piastra di coltura tissutale 24-bene (per la clonazione, preparare pozzetti per 2 x numero di costrutti). A seguito di conseguenza, seguito piastra escrescenza out 25 ml e 25 ml di una diluizione 1: 5 della cultura sul agar contenente 24 pozzetti piastre di coltura dei tessuti. Stendere le cellule inclinando leggermente la piastra. Essiccare la piastra con il coperchio per 10-15 minuti a 37 ° C o in un flow cappa a temperatura ambiente. Rimettere il coperchio e girare la piastra di testa in giù e incubare una notte a 37 ° C. Scegli due colonie e mini-preparazione i vettori. PCR verificare i costrutti utilizzando il costrutto specifico primer reverse e un primer forward vettore specifico (ad esempio pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG). 2. Trasformazione di E. coli E Ceppi xpression Nota: Prima di eseguire questo protocollo, E. cellule competenti coli sono fatti, aliquotati e conservati congelati a -80 ° C, come descritto in precedenza 13. Espressione della proteina di membrana viene costantemente controllato in due ceppi, Lemo21 (DE3) e C41 (DE3) pLysS. Per facilitare l'interpretazione dei risultati può essere utile includere un controllo positivo, ad esempio un plasmide che esprime GFP o una proteina di membrana fusa alla GFP noti per esprimere e un controllo negativo vettore vuoto. Scongelare la aliquotted E. coli su ghiaccio. Aggiungere 3 ml di mini-prepped plasmide di espressione per ogni aliquota di cellule competenti. Incubare la miscela in ghiaccio per 30 min. Heat-shock le cellule per 30 secondi a 42 ° C. Consentono alle cellule di recuperare in ghiaccio per 2 minuti e poi aggiungere 300 ml di brodo di potere ad ogni provetta. Incubare per 1 ora in un incubatore statico 37 ° C. Preparare il LB Agar in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti, integrata con 50 mg / ml e carbenicillina 35 mg / ml cloramfenicolo. Aggiungere ramnosio ad una concentrazione finale di 0,25 mM ai pozzetti contenenti Lemo21 (DE3). Nota: Se il prodotto è probabile che sia tossico i pozzetti contenenti C41 (DE3) pLysS può essere integrato con 1% (w / v) di glucosio. Trasferire 30 ml di cellule dal mix di trasformazione sulle piastre LB Agar. Stendere e asciugare la piastra come descritto in 1,13-1,15. 3. Preparazione di colture starter Overnight <p class= "Jove_content"> Nota: preparare sempre le culture durante la notte il giorno dopo la trasformazione mai da una vecchia piastra di trasformazione. Aggiungere 0,7 ml di potenza brodo a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti profondi ben integrato con 50 mg / ml carbenicillina e 35 ug / ml di cloramfenicolo. Aggiungere ramnosio ai pozzetti contenenti Lemo21 (DE3) ad una concentrazione finale di 0,25 mM. Facoltativamente, integrare C41 (DE3) pLysS con 1% (w / v) di glucosio; vedi sopra (2.6 nota). Scegli una colonia dalle piastre di trasformazione durante la notte in ogni pozzetto. Sigillare il blocco con un sigillo gas-permeabile. Agitare il blocco a 250 rpm in un incubatore con un grande lancio (es orbita 25 mm) o a 600 rpm in un incubatore con una piccola laterale (es un'orbita 4,3 millimetri) a 37 ° C durante la notte. 4. La crescita e induzione delle Culture Aggiungere 3 ml di brodo di potenza integrato con 50 mg / ml e carbenicillina 35 mg / ml di cloramfenicolo ogni well di 24 pozzetti profondo bene. Aggiungere L-ramnosio (e glucosio), come descritto nella sezione 3.1. Utilizzare 3 ml di coltura per permettere la raccolta in duplicato e per consentire una certa evaporazione dell'acqua attraverso la tenuta permeabile ai gas. Impostare le culture di espressione con l'aggiunta di 150 ml di Lemo21 (DE3) o C41 (DE3) pLysS culture durante la notte in ogni pozzetto dei blocchi 24 e profondo bene. Agitare i blocchi a 37 ° C finché la OD media a 595 nm è ~ 0,5 attraverso la piastra. Indurre l'espressione aggiungendo IPTG alle culture ad una concentrazione finale di 1,0 mM IPTG. Far crescere le culture durante la notte (18-20 h) con agitazione a 20 ° C. 5. Analisi di Expression da In-gel fluorescenza Raccolto in duplice copia. Trasferire 1 ml della cultura da ogni pozzetto in una, fondo conico, blocco quadrato ben 96 ben profondo bene. Nota: Harvest in duplice copia in caso di rottura del blocco o per consentire la sperimentazione della correntdetersivo ve se lo si desidera. Sigillare i blocchi e raccogliere le cellule per centrifugazione a 6.000 xg per 10 min. Capovolgere il blocco e decantare la media. Toccare il blocco delicatamente su un tovagliolo di carta per drenare supporti rimanenti. Sigillare le piastre e conservare a -80 ° C per un minimo di 20 min. Facoltativamente, lasciare l'esperimento a questo punto e il blocco trasformati quando conveniente. De-gelo i pellets per 20 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare una pipetta multicanale o un agitatore orbitale (1000 rpm per 10 min) a 4 ° C per risospendere completamente le cellule in 200 microlitri di tampone di lisi (50 mM NaH 2 PO 4, NaCl 300 mM imidazolo 10 mM 1% v / v Tween 20, regolare il pH a 8,0 con NaOH). Aggiungere 20 ml di soluzione DLPI (20 microlitri DNaseI (4.000 unità / ml), 20 mg, lisozima e 20 microlitri cocktail inibitore di proteasi in un volume finale di 2 ml di acqua). Incubare per 10 minuti con agitazione (~ 1000 rpm) a 4 ° C. <li> Aggiungi 25 ml di 10% n -Dodecyl β-D-maltoside (DDM). Incubare per 60 minuti con agitazione (~ 1000 rpm) a 4 ° C. Centrifugare il blocco profondo bene a 6.000 xg per 30 min a 4 ° C. Trasferire 10 ml di lisato eliminato per una piastra di microtitolazione e aggiungere 10 ml di tampone di SDS PAGE gel loading (Tris 100 mM, pH 6,8, 4% w / v SDS, 0,2% w / v blu di bromofenolo, 10% v / v β -mercaptoethanol, e il 20% v / v glicerolo). ATTENZIONE! Non bollire CAMPIONE. Carico 10 microlitri di campione dal punto 5.11 / pozzetto su SDS PAGE gel (s) e funzionano a 100-120 V (tensione costante) in una camera fredda finché il fronte del colorante raggiunge il fondo (2-2,5 ore). Posizionare il gel su un imager (ad esempio con un filtro blu-luce per rilevare le proteine ​​GFP fusione). Il tempo di esposizione è scelta in modo che le bande più brillanti non sono saturi. 6. Scale-up di colture cellulari Trasformare una aliquota di competenza <em> E. coli come descritto nella sezione 2. Scegli una colonia in 10 ml di brodo di potenza (integrato come descritto nella sezione 3) e crescere durante la notte a 37 ° C. Diluire 5 ml di coltura durante la notte in 500 ml di brodo di alimentazione. Grow con agitazione a 250 rpm a 37 ° C finché la densità ottica a 595 nm è ~ 0,5. Indurre l'espressione aggiungendo IPTG ad una concentrazione finale di 1,0 mM. Crescere una notte con agitazione a 250 rpm a 20 ° C. Celle di raccolta per centrifugazione a 5.000 xg per 15 min. Surnatante Rifiuta. Pellet cellulari possono essere conservati a -80 ° C. 7. Preparazione di Membrane Cellule Scongelare (se necessario) a temperatura ambiente e risospendere in 1x PBS pH 7,5 ad un volume di 5 ml per grammo di pellet cellulare; Aumentare il volume, se necessario, fino a quando la viscosità si riduce ad una consistenza liquida. Aggiungere MgCl 2 alla concentrazione finale di 1 mM, DNAsi I a concentrazione finale di 10 mg / ml e unopre-confezionati proteasi tablet inibitore per 20 g di pellet. Rottura celle aperte con un disgregatore cella refrigerata ad una pressione di 30 kpsi. Agglomerare le cellule intatte e detriti a 30.000 g per 15 minuti a 4 ° C. Trasferire il surnatante in un tubo ultra-centrifugazione. Raccogliere la frazione totale membrana riducendo la velocità del supernatante in un ultra-centrifugare a 200.000 xg per 1 ora a 4 ° C. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet membrana ghiacciate 10 ml PBS pH 7.5 utilizzando un omogeneizzatore cellulare. 1 ml membrane risospese sono necessari per ogni detersivo. Facoltativamente, in questa fase, flash congelare la sospensione della membrana in azoto liquido e conservare a -80 ° C. 8. solubilizzazione e Analisi della Frazione Membrane Scongelare frazione di membrana (se necessario), e per ogni detersivo da utilizzare per solubilizzazione, aliquote di 900 ml di sospensione di membrana in un 1,5 ml polyallomer micro-centrifugotubo ge. Aggiungere 100 pl di ciascun detergente preparata di fresco (10% w / v soluzioni di DDM, DM, Cymal-6 e LDAO) ad una concentrazione finale di 1% al tubo 1,5 ml specificato. Per solubilizzazione di proteine ​​di membrana eucariotica emisuccinato colesterolo (concentrazione finale 0,2%) può essere aggiunto ai detergenti. Incubare le miscele a 4 ° C per 1 ora con blanda agitazione. Pellet detergente frazione insolubile con un banco superiore ultra-centrifuga, assicurando tubi sono almeno mezzo pieno, a 150.000 g a 4 ° C per 45 min e mantenere surnatante. Nota: L'efficacia di detersivo solubilizzazione può essere stimata utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza misurando la fluorescenza GFP delle membrane solubilizzate con il detersivo frazione insolubile risospese nello stesso volume di PBS. Analizzare il mono-dispersità del diverso detersivo: complessi di proteine ​​di membrana mediante cromatografia fluorescenza rilevati dimensioni esclusione (FSEC). Per l'analisi FSEC, equilibrare una colonna esclusione dimensioni con una vasta gamma di frazionamento, ad esempio 5.000 a 5.000.000 nel peso molecolare, con tampone di corsa (20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,03% DDM) ad una portata di 0,3 ml / min . Utilizzare questo buffer per tutti i campioni, cioè non è cambiato per ogni detersivo testato. Iniettare 100 ul di membrane solubilizzate sulla colonna ad una velocità di flusso di 0,3 ml / min. Monitorare profilo eluizione utilizzando ottiche fluorescenza (eccitazione a 488 nm ed emissione a 512 nm). Se un monitor linea fluorescenza non è disponibile, raccogliere le frazioni e leggere la fluorescenza in un lettore di piastre. Importa volume di eluizione e dati intensità di fluorescenza in un foglio di calcolo per la visualizzazione grafica. Analizzare restante materiale della membrana solubilizzato da in-gel di fluorescenza come descritto nel capitolo 5.