الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em> الإشريكية القولونية</em
Summary
ويرد نهج مبسط لفحص للتعبير عن بروتينات الغشاء المؤتلف في القولونية استنادا إلى الانصهار البروتين الفلوري الأخضر.
Abstract
يبقى إنتاج بروتينات الغشاء المؤتلف للدراسات الهيكلية والوظيفية تحديا تقنيا بسبب انخفاض مستويات التعبير وعدم الاستقرار المتأصل في العديد من البروتينات الغشاء يذوب مرة واحدة في المنظفات. ووصف البروتوكول الذي يجمع بين ربط الاستنساخ مستقلة عن بروتينات الغشاء كما اندماج مع GFP التعبير في الإشريكية القولونية الكشف عنها بواسطة GFP مضان. وهذا يتيح للبناء والتعبير فحص متعددة بروتين الغشاء / المتغيرات لتحديد المرشحين المناسبين لمزيد من الاستثمار من الوقت والجهد. يستخدم مراسل GFP في الشاشة الرئيسية التعبير من خلال وضع تصور GFP مضان التالية SDS هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS-PAGE). بروتينات غشاء التي تظهر سواء على مستوى التعبير عالية مع الحد الأدنى من التدهور كما يدل على ذلك عدم وجود GFP مجانا ويتم اختيار، على شاشة الثانوية. يتم تحجيم هذه التركيبات ومجموع جزء الغشاء إعداد وذوباند في أربعة المنظفات المختلفة. وبعد تنبيذ فائق لإزالة المواد غير القابلة للذوبان، المنظفات، ويتم تحليل لست] من خلال الكشف مضان استبعاد حجم اللوني (FSEC). رصد الملف الشخصي حجم الإقصاء من قبل GFP مضان يوفر معلومات حول أحادية التبعثر وسلامة بروتينات الغشاء في المنظفات المختلفة. البروتين: تركيبات المنظفات التي أزل مع ذروة متناظرة مع ضئيلة أو معدومة مجانا GFP والحد الأدنى التجميع هي المرشحين لتنقية اللاحقة. باستخدام المنهجية المذكورة أعلاه، والتعبير مغاير في E. تم تحليل القولونية من SED (الشكل، استطالة، وتقسيم، وتبوغ) البروتينات من 47 نوع مختلف من البكتيريا. يكون لهذه البروتينات عادة عشرة المجالات عبر الغشاء وضرورية لانقسام الخلايا. وتظهر النتائج أن إنتاج orthologues عنيزة في E. كان القولونية اختلافا كبيرا فيما يتعلق مستويات التعبير وسلامة البروتينات GFP الانصهار. ط التجربةdentified مجموعة فرعية لمزيد من التحقيق.
Introduction
وتشير التقديرات إلى أن البروتينات الغشاء تمثل حوالي 20-30٪ من الجينات المشفرة في جميع الجينوم التسلسل 1، بما في ذلك الجينوم البشري (2). نظرا لدوره الحاسم في العديد من العمليات البيولوجية، لنقل مثلا من نواتج الأيض، وتوليد الطاقة وكأهداف المخدرات، وهناك اهتمام كبير في تحديد هيكل ثلاثي الأبعاد الخاصة بهم. ومع ذلك بالمقارنة مع البروتينات القابلة للذوبان، والبروتينات الغشاء هي غاية ممثلة تمثيلا ناقصا في بنك معلومات البروتين. في الواقع، من 99624 الهياكل صدر في PDB ( http://www.rcsb.org/pdb/ ) فقط 471 ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ تصنف)، والبروتينات الغشاء. وهذا يعكس الصعوبات التقنية في العمل مع بروتينات غشاء التي يتم التعبير عنها بشكل طبيعي في مستويات منخفضة نسبيا؛ رودوبسين هي واحدة من عدد قليل من الاستثناءات 3،4. وعلى مدى التعبير عن النسخة المؤتلف الصورة في الخلايا مغاير غالبا ما يؤدي إلى misfolding والفقراء استهداف لغشاء مما يحد من المستوى العام للإنتاج. اختيار أفضل المنظفات لاستخراج والإذابة من بروتين الغشاء مرة واحدة وأعرب يجعل تنقية اللاحقة صعبة وتتطلب التحسين دقيق.
لا تزال القولونية المضيف التعبير الأكثر استخداما للبروتينات غشاء يمثل 72٪ ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) هياكل حلها حتى الآن والتي هي على وجه الحصر تقريبا من مصادر بكتيرية. E. محدد سلالات القولونية، C41 (DE3) وC43 (DE3)، وقد تم عزل التي لا تؤدي إلى الإفراط في التعبير عن بروتينات الغشاء، وبالتالي تجنب آثار سمية لوحظ لBL21 آخر سلالات 5،6. ضبط مستوى المؤتلف التعبير البروتين غشاء يبدو أن تكون حاسمة لتحسين مستوى الإنتاج 6،7.
<p class="jove_content"> وفي كثير من الحالات قد يتطلب إنتاج الناجح للبروتينات الغشاء لتحديد هيكل تقييم إصدارات متعددة بما في ذلك جذر الأمينو والحذف-كربوكسي المحطة، orthologues متعددة لاستغلال الاختلاف التسلسل الطبيعي والبروتينات الانصهار المختلفة 6-8. لذلك، وهي طريقة لفحص التعبير عن بروتينات الغشاء متعددة في نفس الوقت أمر ضروري. واحد النهج المتبع عادة هو صهر البروتين لبروتين الفلورية الخضراء (GFP) التعبير تمكين لتعقبها دون الحاجة لتنقية البروتين. وبهذه الطريقة، معلومات عن مستوى التعبير والاستقرار والسلوك في المنظفات المختلفة يمكن تقييمها مع كميات صغيرة من المواد النقية الامم المتحدة 9-12.في هذه المقالة وصفنا بروتوكول مبسط للاستنساخ والتعبير فحص بروتينات الغشاء في E. القولونية باستخدام الانصهار لGFP كمراسلة الإنتاج وتوصيف لاحق من المنظفات: البروتين شركاتLEXES (الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
في بروتوكول الموضحة في هذه المقالة، يتم الجمع بين ربط الاستنساخ مستقل في ناقلات مراسل GFP مع الكشف عن مضان للكشف بسرعة التعبير النسبي للبروتينات الغشاء متعددة في E. القولونية. ناقلات ويمكن إجراء في أربعة أيام عمل مع الفحص التعبير الأساسي تتخذ أسبوع آخر. في جل يستخدم مضان لست] المنظفات الخلايا بأكملها إلى رتبة التعبير يضرب لمزيد من التحليل في الشاشة الثانوية. الشاشة التعبير الأساسية كما وردت لا يتطلب أي معدات متخصصة وبصرف النظر عن حاضنة شاكر مناسبة للخلايا تنمو في كتل بئر عميقة. جميع مناولة السائل الآخر تنطوي 96-جيدا لوحات SBS يمكن القيام بها باستخدام الماصات متعدد القنوات. بروتوكول يمكن تعديلها بسهولة لتشمل سلالات القولونية E. أخرى نمت في ظل ظروف التعبير المختلفة (مثل انخفاض درجة الحرارة). في حالة LEMO21 (DE3) المعايرة مستوى رامنوز (0-2،0 ملم)وأضاف لتعديل معدل النسخ يمكن أن تزيد من مستوى التعبير عن بعض البروتينات الغشاء 7. المنظفات الأخرى من DDM يمكن أن تستخدم لاستخراج في الشاشة الرئيسية على الرغم من المنظفات أقسى قد ذوبان البروتينات من الهيئات إدراج وبالتالي تعطي ايجابيات كاذبة. ومن الواضح أن أكثر وضع تصبح الشاشة الأولي، والمزيد من التجربة تستغرق وقتا طويلا.
ينطوي على الشاشة الثانوية إعداد إجمالي جزء من الغشاء يضرب التعبير المحددة في الشاشة الرئيسية. هذا هو خطوة حاسمة لأنها سوف تأكيد توطين البروتينات الانصهار إلى غشاء من E. خلايا القولونية. ويتم رصد استخراج احق من البروتين GFP الانصهار في المنظفات مختلفة كل مضان الكشف عن حجم الإقصاء اللوني من المواد تذوب لتقييم أحادية التبعثر من المجمعات المنظفات البروتين. هذا هو خطوة حاسمة أخرى نظرا لأنه يحدد المنظفات الأنسب لذوبانية البروتين غشاء لالتجهيز النهائي لاحق. ومع ذلك، تبين التجربة أن المزيد من التحسين من اختيار المنظفات (ق) قد لا تزال هناك حاجة خلال تنقية والتبلور. دليل السلوك موحد في المنظفات المختلفة بما في ذلك تلك التي تحتوي على حجم مذيلة صغير نسبيا (على سبيل المثال LDAO) ويبدو أن مؤشر جيد على الميل لتشكيل جيدا الانعراج بلورات على الأقل للبروتينات غشاء أولية النواة 14. وفي هذا الصدد الشخصى تعرض لبروتين الغشاء في الشكل 2B يبدو مواتية للغاية.
والميزة الرئيسية لاستخدام مراسل GFP هو أنه يعطي قراءة التدريجي السريع التعبير في عينات تنقيته الامم المتحدة. والعيب هو أن البروتين GFP الانصهار لابد من إزالتها خلال عملية تنقية البروتين لبلورة. في حالة ناقلات المستخدمة هنا، وهو موقع البروتيني فيروسات الانف 3C تمكن الانقسام من GFP. بدلا من ذلك، فإنه واضح ومباشرلإعادة استنساخ البروتينات مرشح، التي تم تحديدها في الشاشة، إلى ناقلات التي تضيف فقط polyhistidine أو غيرها من العلامة تقارب لتنقية اللاحقة. وهذا يفترض أن الاندماج لGFP ليس من الضروري للتعبير. البديل الرئيسي لاستخدام الانصهار لGFP للكشف عن التعبير بروتين الغشاء والإذابة هو فقط إضافة علامة الحامض الاميني. ولكن هذا النهج يتطلب عادة بدءا من جزء غشاء 15 التي لتقييم العديد من المتغيرات سيصبح جدا تستغرق وقتا طويلا.
وباختصار، فإن الغرض الرئيسي من بروتوكول الموضحة في هذه المقالة هو تمكين عدد كبير من تسلسل البروتين غشاء المتغيرات التي سيتم تقييمها بسرعة من حيث التعبير والمنظفات الإذابة والأولوية لتحليل أعمق.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The OPPF-UK is funded by the Medical Research Council, UK (grant MR/K018779/1) and the Membrane Protein Laboratory by the Wellcome Trust (grant 099165/Z/12/Z).
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number |
| pOPIN-N-GFP | addgene (www.addgene.org) | |
| pOPINE-3C-GFP | addgene (www.addgene.org) | |
| C41(DE3)pLysS | Lucigen (http://lucigen.com/ | 60444-1 |
| LEMO21(DE3) | New England Biolabs | C2528H |
| In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns | Clontech/Takara | 639688 |
| Power broth | Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/) | MD12-106-1 |
| Protease Inhibitor tablets | Roche | 11697498001 |
| cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 |
| L-Rhamnose monohydrate | Sigma-Aldrich | 83650 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 |
| DNAse 1 | Sigma-Aldrich | DN25 |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 |
| Cholesterol hemisuccinate | Sigma-Aldrich | C6512 |
| CYMAL-6 ( 6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside) | Anatrace | C326 |
| DDM ( n-Dodecyl ß-maltoside ) | Generon | D97002 |
| DM (n-Decyl ß-maltoside) | Generon | D99003 |
| LDAO ( N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide) | Generon | D71111 |
| E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 ul | Thermo Scientific | 4672030 |
| Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1200µL LTS Spacer | Anachem | LA6-300XLS |
| Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20µL LTS | Anachem | L8-20XLSPLUS |
| Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1200µL LTS Tip | Anachem | L8-1200XLS |
| 24 well V bottom deep well blocks | Porvair sciences | 360115 |
| BenchMark Fluorescent Protein Standard | Life Technologies | LC5928 |
| NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well | Life Technologies | WG1203BOX |
| XCell4 SureLock Midi-Cell | Life Technologies | WR0100 |
| Vibramax 100 | Heidolph | 544-21200-00 |
| Tension rollers attachment | Heidolph | 549-81000-00 |
| ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor | Beckman Coulter | 393253 |
| Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 393315 |
| Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors | Beckman Coulter | B14535 |
| Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector | Shimadzu | |
| Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
| SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 RPMs | Shel Lab | SSI5R-HS |
| Innova44R incubator | New Brunswick /Eppendorf | Innova44R |
| TS SERIES 0.75KW DISRUPTER 230V 50HZ 1PH (40KPSI) | Constant systems | PL083016 |
| L-Rhamnose monohydrate | Sigma | 83650 |
References
- Wallin, E., von Heijne, G. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Sci. 7 (4), 1029-1038 (1998).
- Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G., Uhlen, M., Berglund, L. Prediction of the human membrane proteome. Proteomics. 10 (6), 1141-1149 (2010).
- Okada, T., et al. X-Ray diffraction analysis of three-dimensional crystals of bovine rhodopsin obtained from mixed micelles. J Struct Biol. 130 (1), 73-80 (2000).
- Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
- Wagner, S., et al. Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).
- Schlegel, S., et al. Optimizing membrane protein overexpression in the Escherichia coli strain Lemo21(DE3). J Mol Biol. 423 (4), 648-659 (2012).
- Chun, E., et al. Fusion partner toolchest for the stabilization and crystallization of G protein-coupled receptors. Structure. 20 (6), 967-976 (2012).
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat Protoc. 3 (5), 784-798 (2008).
- Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507 (2), 220-224 (2001).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 13936-13941 (2007).
- Busso, D., et al. Expression of protein complexes using multiple Escherichia coli protein co-expression systems: a benchmarking study. J Struct Biol. 175 (2), 159-170 (2011).
- Sonoda, Y., et al. Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
- Low, C., et al. High-throughput analytical gel filtration screening of integral membrane proteins for structural studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (6), 3497-3508 (2013).
