De isolatie van individuele dopamine neuronen of het ventrale tegmentale met directe of indirecte immunohistochemie wordt aangetoond met behulp van lasermicrodissectie. Parameters voor isolatie van weefsel uit een glasplaatje met een infrarood laser en van membraansystemen dia met de combinatie van infrarood en ultraviolet laser besproken.
Laser capture microdissectie (LCM) wordt gebruikt om een geconcentreerde populatie van afzonderlijke cellen of exacte anatomische gebieden van weefsel van weefselcoupes isoleren op een microscoopglaasje. In combinatie met immunohistochemie kan LCM worden gebruikt om individuele celtypen basis van een specifiek eiwit marker isoleren. Hier wordt de LCM techniek beschreven voor het verzamelen van een specifieke populatie van dopamine neuronen direct gemerkt met tyrosine hydroxylase immunohistochemie en voor isolatie van de dopamine neuron bevattend gebied van het ventrale tegmentale gebied met indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemie op een gedeelte naast die voor LCM. Een infrarood (IR) laser capture wordt gebruikt om zowel ontleden individuele neuronen en het ventrale tegmentale gebied voor objectglaasjes en op een LCM dop voor analyse. Volledige dehydratatie van het weefsel 100% ethanol en xyleen kritisch. De combinatie van de IR laser capture en ultraviolet (UV) cutting laser wordt gebruikt om individuele dopamine neuronen of het ventrale tegmentale gebied isoleren bij gebruik PEN membraan slides. Een PEN membraan schuif heeft significante voordelen boven een glasplaatje omdat daarmee een betere samenhang in het vangen en verzamelen van cellen sneller verzamelen van grote stukken weefsel, minder afhankelijk uitdroging en leidt tot volledige verwijdering van het weefsel van de glijbaan. Hoewel verwijdering van grote delen van weefsel uit een glasplaatje haalbaar is aanzienlijk meer tijd in beslag en laat vaak vanuit enig resterend weefsel. De gegevens hier tonen dat RNA van voldoende hoeveelheid en kwaliteit kan worden verkregen met gebruik van deze procedures voor kwantitatieve PCR metingen. Hoewel RNA en DNA zijn de meest geïsoleerde moleculen uit weefsels en cellen verzameld LCM, isolatie en meting van microRNA, eiwitten en epigenetische veranderingen in het DNA kunnen ook profiteren van de verbeterde anatomische en cellulaire resolutie verkregen middels LCM.
Alle weefsel bestaat uit een heterozygote populatie van cellen. Dit is met name relevant voor hersenweefsel, bestaande uit verschillende morfologisch en / of neurochemisch verschillende neuronen, omringd door verschillende soorten gliacellen (oligodendrocyten, microglia en astrocyten). Bovendien onderscheiden gebieden in de hersenen, zoals gebieden van de cortex of hersenstam kernen specifieke functies. Daarom is de mogelijkheid om specifieke populaties van cellen of kleine anatomisch verschillende gebieden te isoleren, in combinatie met analytische technieken (bijv Q-PCR, microarrays, RNA-sequencing en proteomics) kan aanzienlijk het inzicht in verschillende biologische processen. LCM is een technologie die de mogelijkheid om zeer discrete anatomische gebieden of specifieke cellen te isoleren uit weefsel op een microscoopglaasje zodat een veel homogenere bron voor verdere analyse van verschillende moleculen, zoals RNA, microRNA, DNA en eiwitten verschaft.
t "> Sinds LCM werd geïntroduceerd, zijn verschillende benaderingen gebruikt om cellen microdissect uit weefsel 1-3 De eerste benaderingen onder directe bevestiging van weefsel op een dia met een infrarood (IR) laser en een thermoplastische film en een niet. contact methode waarbij een ultraviolet (UV) laser snijden van een cel of weefsel en verzamelen in een buis los. Vervolgens LCM is met succes toegepast op een verscheidenheid van weefsels en celtypen en getoond verenigbaar met isolatie van verschillende moleculen downstream analyse waaronder RNA, microRNA, DNA en eiwitten, waaronder enzymatische activiteit 1,4-7. Hier LCM wordt aangetoond door middel van een LCM systeem dat een snij UV laser en een capture IR laser voor het snijden rond cellen of weefsel en bevestigen aan een gebruikt LCM cap, respectievelijk. Deze LCM systeem gebruikt zowel de IR laser capture een plastic film op een kap over de cel of weefsel van belang dat de cellen gehecht aan de plastic film en verwijderd uit t smeltenHij weefsel met het verwijderen van de kap (figuur 1). Bovendien, in combinatie met de IR laser, een UV laser beschikbaar is uitgesneden weefsel of cellen van interesse uit weefsel aangebracht op objectglaasjes met een membraan vervolgens geïsoleerd door het aanbrengen van het weefsel op de LCM dop met de IR laser (figuur 2). Een kort overzicht van deze technieken is in de figuren 1 en 2.Verscheidene variaties van deze techniek zijn beschreven hetzij isoleren specifieke cellen middels direct fluorescent immunohistochemie en een indirecte immunohistochemie geleide techniek die wordt gebruikt voor het isoleren van een gebied van weefsel op basis van de expressie van een specifiek eiwit. Specifiek, de isolatie van dopamine neuronen van de substantia nigra en isolatie van het ventrale tegmentale gebied en de daaropvolgende isolatie van RNA uit vers, bevroren hersenweefsel getoond. RNA is het meest labiele moleculen gemeten (vergeleken met DNA of eiwit), steps op de instandhouding van RNA integriteit zijn opgenomen en de gegevens die op de kwantiteit en kwaliteit van RNA verkregen.
LCM is een techniek om de ontleding van discrete populaties van cellen of gebieden van weefsel van weefselcoupes op een microscoopglaasje en de daaropvolgende isolatie van RNA, microRNA, DNA en eiwitten. Het gebruik van LCM in combinatie met de analyse met behulp van high-throughput technologieën zoals microarray, next generation RNA sequencing, epigenetische analyse van DNA en proteomics wordt steeds vaker de gevoeligheid van deze technieken verhoogt de hoeveelheid uitgangsmateriaal nodig vermin- 8-12. Met LCM, is een betere anatomische resolutie bereikt voor een monster, en het begrip van de downstream-maatregelen van deze monsters is sterk verbeterd. Een waarschuwing met LCM is dat het een geconcentreerd monster van de cellen van belang, maar niet noodzakelijkerwijze een zuivere populatie van cellen. De grenzen van de nauwkeurigheid betekenen dat er enige verontreiniging van aangrenzende weefsel wordt. Deze techniek concentreert wel de cellen van belangeffecten geassocieerd met omringende weefsels en cellen te minimaliseren en de experimentele effecten op de cellen van belang.
Directe versus indirecte Immunohistochemistry
Aangezien LCM momenteel voornamelijk gebruikt voor de isolatie en meting van RNA, waardoor RNA intact is een belangrijk criterium. Handhaving RNA integriteit de belangrijkste reden achter het gebruik van indirecte immunohistochemie weefsel dissectie waarbij de noodzaak om het weefsel direct vlekken die RNA afbreken verwijdert leiden (Figuur 10). Wanneer de experimentele vraag vereist echter isolatie van een specifieke populatie van cellen, zoals dopamine neuronen wordt direct fluorescent immunohistochemie vereist. Met een snelle immunohistochemische labeling protocol kan de afbraak van RNA minimaliseren tijdens de procedure. De korte incubatietijden zijn door het gebruik van hoge concentraties van primaire en secundaire antilichamen, concentraties die ongeveer 10-20 zijn hoger dan wat nodig is voor conventionele immunohistochemie met een 2 uur incubatie is folden. Wanneer echter langere incubatietijden vereist, Brown en Smith gebruikte hoge zoutbuffers om RNA afbraak te remmen en het verkrijgen van goede kwaliteit RNA met lange incubatietijden (tot 20 uur) 13. Deze benadering kan ook worden gebruikt als er veel tijd nodig is tussen kenmerken van het weefsel en toegang krijgen tot een LCM systeem.
Keuze van dia's – PEN membraan, silaan-prep en ongecoate glaasjes
Het gebruik van ongecoate objectglaasjes voor LCM gemeld 14. In ons laboratorium hebben Silane-prep dia's zijn gevonden om een optimale keuze te zijn, aangezien deze coating voldoende hecht het weefsel om de glijbaan voor immunohistochemie zonder verlies van weefsel, maar nog steeds zorgt voor de bevestiging van het weefsel aan het LCM caps en verwijdering uit de dia . Ongecoate glaasjes hebbentoonde enkele weefsel verlies met de immunohistochemie procedure. Als indirecte immunohistochemie wordt gebruikt, echter weefselretentie wordt minder een probleem. Met de juiste uitdroging, het vastleggen van cellen of weefsels af van silaan-prep dia's heeft geen probleem geweest. Elk van de verschillende benaderingen voor het isoleren van neuronen of hersengebieden beschreven in dit document heeft voor- en nadelen. Voor isolatie van afzonderlijke dopamine neuronen, het gebruik van silaan-prep slides heeft het voordeel van een betere optiek en is minder duur dan de PEN membraan dia. Het nadeel is dat soms vastleggen cellen lastig kan zijn als er onvoldoende uitdroging (zie hieronder) en wat weefsel worden achtergelaten op de dia. Het voordeel van de PEN membranen slides is dat met de combinatie van de IR laser en UV laser waarborgt dat de dopamine neuronen worden verzameld. Niet-cellen van een PEN membraan slides verzamelen vrijwel nooit voorkomt, aangezien het minder afhankelijk uitdroging dan de glasplaatjes. Een Bijkomend voordeel is dat de UV laser kan worden gebruikt om dichter te benaderen de vorm van de neuronen plaats, vergeleken met een cirkel voor het vastleggen neuronen af van objectglaasjes met de IR laser. Voor de isolatie van de regio's van het weefsel, de PEN membraan dia's zijn veruit superieur en de extra kosten te rechtvaardigen. Deze benadering levert volledige verwijdering van het weefsel uitgesneden op het membraan, is veel sneller dan het vastleggen van een groot gebied van weefsel door de IR laser staan dikkere weefselcoupes kunnen worden verzameld. Met alleen de IR-laser vereist dat de LCM dop membraan volledig gesmolten is over het gehele weefsel gebied. Bovendien onvolledige verzameling van het weefsel is typisch en vereist gewoonlijk meerdere pogingen. Hoewel dit duurt langer dan isoleren weefsel van de PEN membraan dia als de beschikbare weefsel reeds op een glasplaatje of een UV laser niet beschikbaar is, is een haalbare optie omdat de meeste weefsel kan worden verzameld (figuur 8J).
ove_content "> Kritische stappen100% ethanol incubaties zijn een van de belangrijkste stappen. Om cellen te verzamelen uit silaan-prep slides volledige dehydratie van het weefsel vereist. Daarom zal geen water verwijderd, die meestal geassocieerd wordt met 100% ethanol incubatie, het vermogen bezitten cellen van de objectglaasjes beïnvloeden. Om dit probleem aan te pakken, vaak veranderen de 100% ethanol oplossingen, omdat de absorptie van water uit de lucht of de transfer van voorgaande stappen wassen kan de uitdroging beïnvloeden. Daarnaast worden moleculaire zeven gebruikt om waterverontreiniging absorberen. Het LCM systeem moet idealiter worden gevestigd in een kleine kamer met een ontvochtiger te lage luchtvochtigheid te handhaven.
Goede cryostaatcoupes zijn cruciaal voor een goede LCM. Secties moet vlak zijn met vouwen in het weefsel geminimaliseerd. Plooien in het weefsel zal de afstand toenemen tussen de LCM dop en voorkomen dat het contact thij weefsel. Het wordt dan moeilijk Membraankap op het weefsel voldoende smelten. Voor glazen plaatjes, meestal sectie dikte moet zijn tussen de 6 en 12 micrometer. Dikkere secties kunnen worden vastgelegd met de PEN membraan glijbanen.
LCM biedt een technische capaciteit om zeer nauwkeurige dissecties van weefsels en cellen te maken uit de microscoop dia's. Dit verhoogt aanzienlijk de resolutie van verdere analyse vergeleken met grove dissectie van stukken weefsel. Hoewel LCM tijd en arbeidsintensief zijn, is het niet nodig uitgebreide training en deskundigheid en, wanneer gekoppeld aan andere high-throughput, kan sterk verbeteren van het begrip van een biologisch proces als afzonderlijke cellen of anatomische gebieden worden gebruikt.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Institute of Mental Health (1R15MH084209 – 01A1), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R21NS058375-01A2) and the National Science Foundation (DBI0723080 07070646).
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Numer | Comments |
Veritas Laser Capture Microdissection System | Life Technologies, Grand Island, NY | Newer model is now sold | |
CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies, Grand Island, NY | LCM0211 | |
CapSure HS LCM Caps | Life Technologies, Grand Island, NY | LCM0213 | |
PEN Membrane slides | Life Technologies, Grand Island, NY | s4651 | |
Silane prep-slides | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S4651 | |
95% Ethanol-RNase Free | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7148 | |
100% Ethanol-RNase Free | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
Rnase Free Triton | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8787 | |
Molecular Sieve | EDM Millipore, Billerica, MA | MX1583D | |
Anti-Tyrosine hydroxyase antibody | EDM Millipore, Billerica, MA | Ab152 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies, Grand Island, NY | A-11008 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2939AA | |
Stratagene MX 3005P | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 401513 | |
Nanodrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ||
Quant-iT RiboGreen | Life Technologies, Grand Island, NY | R11490 | |
RNaseZap | Life Technologies, Grand Island, NY | AM9780 |