Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.
Yüksek çözünürlüklü Fourier Kızılötesi (FT-IR) spektroskopik görüntüleme biyokimyasal bilgi ilişkili olan detaylı görüntüler elde etmek gelişmekte olan bir yaklaşımdır Transform. Doku FT-IR görüntüleme orta kızıl ötesi farklı bölgeleri, varlığı ve bileşimine bağlı olabilir (örneğin, C = O, CH, NH) hücre veya doku içinde farklı kimyasal bağlar tarafından absorbe edilir prensibine dayanır biyomoleküllerin (örneğin, lipidler, DNA, glikojen, protein, kollajen). FT-IR görüntüsü olarak, görüntü içindeki her bir piksel daha sonra, hücre tipi veya hastalık tipi sınıflandırma için yararlanılabilir hücrelerin biyokimyasal durumu hakkında bilgi verebilir tüm Kızılötesi (IR) spektrum içerir. Bu yazıda göstermek: Bir FT-IR sistemini kullanarak insan dokularından IR görüntüleri edinme, yüksek çözünürlüklü görüntüleme yetenekleri için izin ve nasıl FT-IR görüntüleri görselleştirmek için mevcut enstrümantasyon değiştirmek nasıl. Daha sonra FT-IR bazı uygulamaları sunmakpatoloji için örnek olarak karaciğer ve böbrek kullanarak. FT-IR görüntüleme hastalık süreçlerinin bir parçası olarak biyomoleküler değişiklikler yeni fikir veren yönelik tamamen etiket ücretsiz olmayan bozucu rota hücreleri ve doku biyokimyasal bilgi edinmek için yeni bir rota sağlayan heyecan verici uygulamaları tutar. Ayrıca, bu biyokimyasal bilgiler potansiyel hastalık tanısı bazı yönlerinin nesnel ve otomatik analiz için izin verebilirsiniz.
IR spektroskopisi 1930'lardan beri bazı şeklinde kullanılabilir bir analitik araç olmuştur; Ancak, sadece FT-IR ile doku görüntüleme alanı patladı son on yıl içinde be. nedeniyle büyük Odak Düzlemi Array durumu (FPA) genellikle IR duyarlı dedektörler 1 binlerce dedektörler için veri toplama 1) artış hızı: doku görüntüleme için FT-IR gelişmeler üç temel gelişmelerin büyük bir bölümünde tahrik edilmiştir gelişmiş işleme algoritmaları ve büyük hiperspektral verileri işlemek için hesaplama gücü 2, 2) geliştirme 3. setleri, ve FT-IR görüntüleme sistemlerinin 3) modelleme uzaysal çözünürlüğü 4,5 maksimize etmek. Dokulardan 17 point spektrumları veya haritalar elde etmek için adımlar detayı Doğa Protokolleri kağıda ek olarak çok sayıda yüksek kaliteli ve son zamanlarda 6-16 FT-IR spektroskopisi alanını gözden çok geniş makaleler, olmuştur. Bu yazıda, prot üzerinde durulacakocol yüksek çözünürlüklü yetenekleri ile modifiye FT-IR sisteminde 128 x 128 FPA dedektör kullanılarak dokuların görüntüleri elde etmek.
FT-IR görüntüleme uzun nedeniyle her piksel biyokimyasal bilgi hazinesi olan görüntüleri elde etmek için yeteneği hücre ve doku görüntüleme için bir potansiyel arzu araç olarak öne sürülmüştür. FT-IR görüntüleme, bir numunedeki farklı biyomoleküllerin kantitatif orta kızıl ötesi farklı bölgelerini emeceği ilkesine dayanmaktadır; Bu bir 'biyokimyasal parmak izi' türetilmesi için izin verir. Bu parmak izi farklı hücre tipleri ve hastalık durumları arasında değiştirmek için birçok çalışmalarda gösterilmiştir olmuştu. Lekeleri ve immünohistokimyasal belirteçler görselleştirmek ve tanı ve tedavi seçeneklerini yönlendirmek için kullanılan hücre tiplerini ve doku yapıları belirlemek için kullanılması gereken geleneksel patoloji uygulamada aksine, FT-IR görüntüleri doku doğal biyokimya dayanarak oluşturulmuştur. Mevcut techniqTanı için boyama dokusunun vi zaman alıcı, zahmetli, yıkıcı ve FT-IR Bu süreç, hızlı tahribatsız, yüksek otomasyonlu ve daha objektif hale getirmek için potansiyeli sunmaktadır ise, patolog öznel uzmanlık gerektirir. Buna ek olarak, FT-IR, geleneksel boyama teknikleri kullanılarak kolayca erişilebilir olmayabilir ilave biyokimyasal bilgi elde etmek için yeni bir yol sağlar.
Son yılların en heyecan verici gelişmelerden biri artık hücre tipleri ve kapsamlı bir hastalık tanısı için kritik olan doku yapılarının görselleştirme ve karakterizasyonu için izin yüksek çözünürlüklü görüntüleme yaklaşımlarının kullanılabilirliği olmuştur. Bu tekniklerden biri de birçok heyecan verici çalışma uygulamaları 19-25 gösteren, yüksek çözünürlüklü görüntüleme 18 sağlayan bir yüksek kırılma indeksi, bir katı daldırma lens (SIL) içerir zayıflatılmış Toplam Yansıtma (ATR) FT-IR olduğunu. Buna ek olarak, ağırlıkolarak son zamanlarda ATR görüntüleme ile ilişkili artmış uzaysal çözünürlüğü endotelyal ve meme kanseri teşhisi 26 kilit bileşeni oluşturan meme dokusunda miyoepitelyal hücrelerin görselleştirme ve sınıflandırılması için izin olduğunu göstermiştir. ATR görüntüleme çok yararlı olmakla birlikte, bu teknik, FT-IR görüntü oluşturmak için doku ile iletişim kurmak için SIL gerektirmektedir; bu nedenle, bir kullanımı bir bakıma dokuların büyük bir kısmının hızlı bir şekilde görüntülenmiştir gereken doku patolojisi ile sınırlıdır.
İkinci bir yaklaşım IR parlak bir kaynağı olarak bir sinkrotron kullanan varolan bir FT-IR, sisteme yüksek bir büyütme amacı birleştirilmesi ile gösterilmiştir, tamamen 0.54 x 0.54 um etkili bir piksel boyutuna sahip bir FPA ve resmi de aydınlatılması mümkündür. Bize konvansiyonel FT-IR sistemleri 4 kullanılarak çözülebilir değildi meme ve prostat dokularında önemli yapıları görselleştirmek için bu izin. IR görüntü mekansal çözünürlük bu dramatik artışlar olurkenn kullanımı nedeniyle sinkrotron gerektiren sınırlı kalmıştır, heyecan verici idi. Daha sonra, optimal sistem aynı zamanda yüksek çözünürlüklü görüntüleme bir sinkrotron kaynağı gereksinimi olmadan 1.1 x 1.1 mikron piksel boyutu ile yetenekleri değil, geleneksel bir globar IR kaynağı 5 kullanmak için izin verebilir dizayn edilmiştir. Bu makalede, biz çoklu IR hedefleri (15X, 36X ve YOK 74X) kullanarak gürültü oranı kabul edilebilir bir sinyal ile dokuların kırınım sınırlı IR görüntüleme için izin varolan ticari FT-IR görüntüleme sistemi değiştirmek için nasıl gösterir. Üç hedefleri ile etkin piksel boyutu 5.5 x 5.5 mm (15X), 2.2 x 2.2 mm (36X) ve 1.1 x 1.1 mm (YOK 74X). Daha sonra karaciğer ve böbrek biyopsileri 27 hastalık tespiti için mekansal çözünürlükte kazanımların önemini bazı örnekler vermek.
FT-IR patoloji tanı mevcut standart iyileştirmede önemli bir role sahip potansiyeline sahip, doku kesitlerinin etiket ücretsiz biyokimyasal görüntüleme için gelişmekte olan bir yöntemdir. patoloji mevcut altın standart dokular, parafin gömülü, formalin sabit, biopsi birden çok kez kesitli ve birden fazla lekeler ile boyanmış gerektirir. Bir yüksek eğitimli patolog öznel görsel bir tanıyı belirlemek için doku yapısı ve hücresel morfoloji değerlendirmek zorundadır. Burada bölümlerin aynı tip yüksek çözünürlüklü kızılötesi görüntüleri toplamak ve hücre tipleri ve hastalık durumlarında arasındaki kimyasal farklılıkları incelemek için hesaplamalı yaklaşımlar bazı tartışmak nasıl gösterir.
Bu protokol kapsamında kritik adımlar dokular çok dikkatli odaklı olmasını sağlamak için vardır ve sistem de çok kaliteli spektroskopik verileri sağlamak için kalibre edilir. sisteminin kurulması bakım özellikle criti olduğunu cal yüksek büyütme hedefleri ile çalışırken. Sorun giderme yardımcı olmak için, aşağıdaki liste karşılaşılan olası bazı zorlukları kapsar;
Sorun: yansıma görüntüleme Düşük IR şiddeti. Çözüm: yansıtıcı kaplama slayt yanlış tarafında olabilecek IR slayt yönünü kontrol edin.
Sorun: Lancer Kontrol Düşük sinyal / Kırmızı uyarı işareti. Çözüm: LN2 ile serin dedektörler. Sıvı azot çalışması FPA dedektörler için gereklidir ve periyodik tepesinde olmak gerektirir.
Sorun: Hız hatası / hareket hataları. Çözüm: spektrometre Reset ve titreşimleri azaltır. Titreşimler interferometreye hareketli ayna rahatsız neden olur.
Sorun: veri Su buharı ani. Çözüm: sistemde tasfiye artırın ve havadan örnek korumak.
Sorun: Geçersiz centerburst. Çözüm: centerburst bulun.
e_content "> Sorun:. iletim Düşük akı fark odaklı olsa Çözüm:. kızılötesi ışık örnek üzerinde bir noktaya odaklanmış değil gibi alt kondansatörü ayarlayın Bu oluşacaktır.Bu yazıda, iletim veya transflectance modunda ya dokuların yüksek çözünürlüklü kızılötesi görüntüleri elde etmek için nasıl odaklanmıştır. FT-IR görüntüleme doğası, bu tür alt-tabaka tipine tespit tekniği, örnek kalınlığı, spektral çözünürlük, interferometre ayna hızı vb Bu parametrelerin etkisi olarak veri toplama ile yapılabilir çok modifikasyonlar olmasıdır var Son zamanlarda 4,5,17,51 geniş detaylı olarak tartışılmıştır.
ATR modunda 10,24,26 içinde görüntüleme de dahil olmak üzere yüksek çözünürlüklü IR görüntüleme sağlamak için nano ölçekli termal yaklaşımlar 52,53 kullanılarak görüntüleme sistemi yapılabilir değişiklikler vardır. yüksek çözünürlüklü kızılötesi görüntüleme ile ana sınırlama ti olduğunussues (tipik olarak 4 um kalınlığında) üzerinden geçmesi için dikkatli bir şekilde hazırlanan ve IR için yeterince ince olması gerekir. Buna ek olarak, iletim ve yansıtma FT-IR görüntüleme nedeniyle su IR absorbans kuru olmasını örnekleri gerektirir. Ancak, FT-IR görüntüleme ki, diğer tekniklere göre önemli avantajlara sahiptir it can doku çok hızlı görüntü büyük alanlar, zengin ve ayrıntılı biyokimyasal bilgi türetmek ederken. Bir etiket-serbest bir şekilde biyokimyasal bilgileri elde Diğer benzer teknikler Raman spektroskopisi, ancak veri toplama zamanı görüntüleri elde etmek için çok daha yavaş olduğunu bulunmaktadır. Yeni Raman görüntüleme yaklaşımları Uyarılmış Raman saçılımı (SRS) ve Tutarlı Antistokes Raman saçılımı (CARS) dahil ortaya çıkıyor; Ancak, onlar erişim sınırlı spektral aralığı veya tek frekanslı görüntüleme var.
veri toplama, uzamsal çözünürlük ve hesaplamalı yaklaşımlar durumu hızındaki gelişmeler FT-IR imag yapımında büyük değeri olmuşturpatolojide yeni bir görüntüleme aracı olarak çeviri için bir daha uygun bir yaklaşım ing. mekansal çözünürlükte son gelişmeler nedeniyle konvansiyonel FT-IR görüntüleme sistemleri kullanılarak çözülebilir olmayan anahtar hücre tiplerine doku patolojisi için özellikle önemli olmuştur. Reddy ve ark son kağıt. FT-IR görüntüleme sisteminin 5 optimum uzaysal çözünürlüğü elde etmek için ideal bir sistemi modellemek için nasıl gösterdi. Bu yazıda sunulan böbrek doku örneği glomerüler yapılar (Şekil 3 ve Şekil 5) biyokimyasal bilgileri ayıklamak amacıyla daha yüksek uzaysal çözünürlükte önemini ortaya koymaktadır. Gelecekte, Kuantum Cascade Lazerler çok parlak kızılötesi ışık kaynaklarının yeni gelişmeler 54-57, 3D spektral görüntüleme 58, ve nano ölçekli IR teknolojileri alanında devrimler 52,53,59,60 olabilir araştırma heyecan verici yeni yollar tutun doku görüntüleme gelecekte büyük etkileri.
<p cldiagnostik değere sahip olabilir ek biyokimyasal bilgi için bir ihtiyaç vardır burada eşek = "jove_content"> ve karaciğer ve böbrek hastalığı uygulama örnekleri sunulmuştur. Chicago Illinois Üniversitesi Patoloji Anabilim spektral Patoloji Laboratuarı hastalığı tanısı iyileştirilmesine yönelik IR görüntüleme teknolojilerinin çeviri odaklı ve hasta sonucun tahmin artırıldı. FT-IR görüntüleme kantitatif ve objektif bilgiler gerekli patoloji uygulamada mevcut sınırlamalar bazılarının üstesinden gelmek olabilir. Özellikle, gelecekteki iş akım teknikleri yeterli tanı duyarlılığını sağlamak veya sınırlı bilgi sağlamak için başarısız mevcut patoloji uygulamada alanların belirlenmesi üzerine odaklanmıştır. Bir açık bir ihtiyaç patoloji mevcut uygulamaların iyileştirilmesi ve yüksek çözünürlüklü FT-IR görüntüleme kullanarak ulaşılabilir olabilecek bir hastanın hastalık durumu hakkında patolog, daha fazla bilgi vererek doğru var.The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.
Cary 600 Series FT-IR system | Agilent | Multiple configurations | Alternate FT-IR imaging systems exist |
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65NA IR | Edmund Optics | 66-592 | |
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5NA IR | Edmund Optics | 66-586 | |
MirrIR slide | Kevley Technologies | CFR | For FT-IR reflection-mode measurements |
Barium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Calcium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Dry Nitrogen/Dry Air gas | Multiple gas suppliers | Multiple sizes | |
Hexane | Sigma Aldrich | Multiple sizes | For deparafinizing tissue |
Liquid Nitrogen | Multiple cryogenic liquid suppliers | Multiple sizes | |
ENVI-IDL software | Exelis-Vis | Other software packages available | |
Whole slide Imager | Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu) | To image stained slides |