Калиброванный щипцы Модель спинного мозга Компрессия травмы

Все процедуры на животных и методы по уходу за животными должен быть одобрен Институциональные уходу за животными и использование комитета учреждения (IACUC) по. 1. Хирургическая подготовка Соберите все необходимые хирургические инструменты и реактивы: щипцы, Vana ножницы, roungeurs, натяжитель, скальпели, ножницы, швы, скобы кожи, Q-Tips, стерильный физиологический раствор, хирургические губки, и изофлурановой. Подготовка и автоклава полный пакет хирургических инструментов до операции. При выполнении операции на более чем одной мыши, подготовить и автоклав один пакет инструментов на животное, или в автоклаве один пакет хирургических инструментов и стерилизовать с помощью инструмента стерилизатор между ними операций. Как правило, один пакет стерилизованных инструментов могут быть использованы на до 5 мышей, если инструмент terilizer стеклянными шариками используется для очистки инструментов в промежутке между операций (после 5 животных инструменты должны быть повторно очищены и стерилизованы перед использованием). Пожалуйста, свяжитесь с вашим местным IACUC администратора institutiна конкретных рекомендаций. Стерилизовать операционного поля с 70% изопропилового спирта салфетки. Настройка хирургических салфеток для обеспечения стерильной поле поддерживается во время операции. Взвешивание каждой мыши до операции. Администрирование дозы 0,05 мг / кг массы тела бупренорфина, подкожно. Обезболить животное путем введения изофлуран в дозе 4% в индукционной камере изофлуран машины. После того, как животное находится под наркозом, следует применять мазь для глаз, чтобы предотвратить обезвоживание, установите животное на грелку на 37 ° С, и убедитесь, что голова мыши правильно расположен в анестезии конуса. (Примечание: Используйте источник нагрева, который не будет вызывать термические ожоги, то есть циркулирующая вода покрывало, бутылку с горячей водой, или эквивалент.). В этот момент введения дозы 2% изофлуран для животного. Бритье спинной поверхности мыши, примерно 1 см вокруг предполагаемого места разреза. Лечить разреза SITE промывкой 70% -ным изопропиловым спиртом салфеток, а затем с раствором йода (10% повидон-йода, 1% активного йода). Повторите 3 раза. 2. Спинной Ламинэктомия Прежде чем сделать разрез, убедитесь, что животное правильно наркозом, проверяя рефлексы с помощью ног или хвоста метод крайнем случае. Сделайте надрез вдоль грудного отдела позвоночника с скальпелем и лезвия, а затем проверки рефлексов снова. Арка назад, чтобы помочь правильно визуализировать достопримечательности, такие как границы между позвонками. Вырезать через кожу. Вставьте втягивающего держать кожу и фасции назад от спинного мозга. Очистка ткани по обе стороны от позвоночника подвергать мышцы, охватывающие позвоночник. ПРИМЕЧАНИЕ: хирург должен быть знаком с анатомическим ориентирам. Например, нижний угол лопатки соответствует Т7. В верхней части природного кривой спинного мыши является Т12 и может быть использовано в качестве точки отсчета. С рРопер освещение, определить пространство между позвонками. Найти задний конец T10 и сократить мышцы и фасции перпендикулярно межпозвонкового дискового пространства. Вырезать достаточно, чтобы разоблачить остистых и задней пластинки T10. Используя пару штрафа наконечником Дюмон # 5 щипцами, удалить некоторые из ткани из пластинки и остистого отростка, чтобы выставить небольшой кусочек спинного мозга. При необходимости, используйте Пинцет хирургический, чтобы стабилизировать позвоночник. Выполните ламинектомию, вставив одну сторону парой маленьких ножниц Vana вдоль дорсолатеральной стороне позвонка и непосредственно под пластинки. Сделайте маленькие, осторожные ножницы, чтобы прорваться через боковой стороны позвоночного пластинки. Убедитесь, что никакого давления не применяется к спинному мозгу. Повторите с другой стороны. Слегка надавливайте, чтобы остановить кровотечение, при необходимости с Q-Tip или хирургического губкой, заботясь, чтобы не оказывать давление на спинной мозг. ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка гель пенызамачивают в стерильном физиологическом растворе в том случае, кровотечение необходимо контролировать. После того, как разрезы были сделаны, снимите спинной части позвонка и аккуратно очистить все вложения ткани. Используйте соответствующие средства для остановки кровотечения в случае необходимости. 3. спинного мозга сжатия Использование roungeurs или Ламинэктомия щипцов, гарантировать, что боковые стороны спинного мозга свободны от позвоночного кости таким образом, что калиброванные щипцы для компрессионной травмы может расположить по обе стороны от позвоночника. Руки щипцов должны иметь возможность быть размещены в эпидуральное пространство на соседних сторонах спинного мозга и кончиков щипцов должны быть в состоянии достигнуть пол позвоночного канала. Убедитесь, что видимость спинного мозга хорошо. Расположите калиброванный Dumont # 5 щипцы примерно в середине открытой сегмента спинного мозга. Напомним, что герб силыPS должен быть помещен в эпидуральном пространстве на смежных сторон и советы должны касаться пола позвоночного канала, чтобы генерировать воспроизводимые травмы. Осторожно сжать спинной мозг, пока распорки не подключиться. Держите на месте в течение 15 сек. Осторожно освободить сжимающее усилие и удалить пинцетом калиброванные из спинного мозга. Стерильный физиологический раствор должен быть использован, чтобы восстановить гомеостаз до рану закрывают. 4. Рана закрытия Тщательно шов мышечный слой над спинного мозга, заботясь, чтобы не нарушить или оказать давление на спинной мозг. Используйте либо швов или скобок, чтобы закрыть кожу на рану. При использовании газа анестетик, начинают сужаться / выключить анестезии. Администрирование 0,1 мл лактата пальцами на 10 г массы тела, чтобы помочь аккаунт для обезвоживания во время операции и после операции, когда животное находится вялыми и не оправилась от травмы. Решение должно быть Warmed до температуры тела перед инъекцией. Наведите в постельных принадлежностей без клетки. Клетка должна лежать сверху грелку (как описано в 1.1.5) таким образом, что позволяет половины площади клетки, чтобы быть на площадке, в то время как другая половина лежит на прилавке RT, с тем чтобы дать мыши варианты климат, когда он будет амбулаторно. Позаботьтесь, чтобы убедиться, что "восстановление клетка" находится в тихом месте. Внимательно следить за животное, пока он не очнулся, и в это время мышь может быть передано регулярной клетке с подстилкой. 5. Послеоперационный уход После операции вводить дозу 0,05 мг / кг массы тела бупренорфина подкожно каждые 12 ч в течение первых 3 дней после операции, а затем по мере необходимости, чтобы управлять симптомы боли. Администрирование дозы лактата пальцами (0,1 мл на 10 г веса тела подкожно) в течение первых 3 – 5 дней после операции. Дайте эту дозу, если / когдаIMAL начинает демонстрировать признаки обезвоживания вне этого начального периода времени. Вручную выразить мочевой пузырь животных, используя Crede маневр два раза в день. Аккуратно прощупать живот животного, чтобы найти мочевого пузыря, а затем применить нежный понижательное давление, пока мочевой пузырь пуст. Если мочевой пузырь не опустошается или моча кровавое или облачно, управлять 50 мг / кг веса тела в Baytril животному с помощью interperitoneal инъекции в течение 10 дней. Монитор животных на наличие признаков аутофагии, обезвоживания и чрезмерной потери веса (более 20% от массы тела). Если животное испытывает любой из этих симптомов проконсультируйтесь с ветеринаром немедленно в отношении вариантов лечения, или усыпить животное гуманно следующие рекомендации IACUC. Учитывая, что подвижность может быть ограничена, сразу после операции, принять необходимые меры, чтобы убедиться, животные имеют доступ к пище и воде. Предварительно упакованные влажные корма, а такжес гидрогелем, могут быть сделаны доступными для животных в этих случаях. 6. Оценить повреждение тканей, возникающие в результате сжатия травмы Обезболить животное, как описано в шагах 1,4 и 1,5. Проверьте глубину анестезии пальца щепоткой и мониторинга роговицы мигания рефлексов. Когда животное нечувствителен к стимулам, перейдите к шагу 6.2. Выполните внутрисердечной перфузии 10. Защиту грудную полость и вставить иглу в левый желудочек. Промыть существующие жидкости с 20 – 30 мл охлажденного на льду забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) с последующим 15 – 25 мл охлажденного льдом 4% параформальдегида (PFA). Удалить спинной мозг. Отрежьте спинной кожи к спинному мозгу и убрать лишнюю ткань, окружающую длину позвоночника. Акцизный позвоночника и отрезать оставшийся ткани. Фактический уровень ламинектомии и яnjury может быть подтверждено путем подсчета ребер. Используйте Vanna ножницы и пинцет, чтобы вытеснить небольшие участки позвоночника в направлении хвостовой-к-ростральная. Продолжить, чтобы сократить до мозга не подвергается достаточно, чтобы позволить безопасное удаление. Визуализация местоположении резания и процесс может быть облегчен путем использования стереоскопе. Поместите ткани спинного мозга в 4% PFA. Разрешить ткани к пост-исправления в этом растворе в течение 24 ч при 4 ° С. Cryoprotect ткани путем инкубации в 30% сахарозы в течение 24 ч при 4 ° С. Код для вставки ткани в октябре Короче говоря, взять ткань из 30% сахарозы инкубации и удалите излишки раствора. Поместите ткань в cryomold наполненной октября и инкубировать в течение 1 ч при 4 ° С. Удалить плесень от 4 ° C, подтверждают направленного ориентацию ткани, поставить форму в мелкую тарелку 2-метилбутан (предварительно охлажденной в течение 1 ч на сухом льду) и позволяют октября полностью затвердеть. Держите на сухом льду, если использовать немедленно или СТОповторно при -80 ° С. Отрежьте ткань в 20 мкм сагиттальных срезах с помощью криостата. Гора ткани непосредственно на слайдах. Хранить при температуре от -20 ° С до использования. Выполните гематоксилином и эозином (H & E) пятна. Вкратце, увлажняет ткань (5 мин, 2 раза), пятно гематоксилин (2,5 мин) и промывают водой (1 мин, 2 раза). Инкубируйте ткани в 50%, а затем 70% -ным этанолом (3 мин каждый), краситель с эозином (45 сек), и обезвоживают путем инкубации в 90% (5 сек), 95% (5 сек), 100% этанол (2 мин) и изопропанол (2 мин). Ясно в ксилоле (5 мин, 3 раза). ПРИМЕЧАНИЕ: H & E окрашивание будет меняться в зависимости от конкретной толщины слоя и условий ткани. Таким образом, стандартизация необходима, прежде чем приступить экспериментальные тканей образцов. Покрытие ткани с тонкой полоской предметный столик Permount (~ 100 мкм) и покровное. Нажмите вниз на всех сторонах покровное, чтобы обеспечить надлежащее распределение жидкости. Пусть скользит сухой O / N. Visualize срезах тканей с использованием цифрового микроскопа захвата изображения с помощью прилагаемого программного обеспечения.