Isolering och Kvantitativ Immuncytokemiska karakterisering av primära myogena celler och fibroblaster från Human skelettmuskulatur

Reparation och förnyelse av skelettmuskulatur kräver åtgärd av satellit celler ^1, de myogena stamceller ^2,3. In vivo dessa celler finns i ett reversibelt vilotillstånd belägen mellan sarcolemma och basala lamina varje myofibre, men att aktiveras för att föröka sig, säkring och differentiera som muskelvävnad är skadad, repareras och regener ^3. Satellit celler kan isoleras från unga och äldre människans muskelbiopsiprover med enzymatisk spjälkning ⁴ och deras myogena egenskaper kan därefter studeras i primär kultur ^5. Effektiviteten i denna isolering process när det gäller både utbytet och renheten av cellpopulationen beror på vilka metoder som används och kan variera från prov till prov. De två viktigaste vidhäftande celltyper som erhållits från enzymatisk nedbrytning är satellitceller (numera benämnda myogena celler eller muskel prekursorceller), identifierade ursprungligen som CD56 ⁺ / desmin celler och muscle-härledda fibroblaster, som identifierats som CD56 ^– och TE7 ⁺ celler ^5. Fibroblaster har en snabb proliferativ takt och inte genomgår irreversibel tillväxt gripande och terminal differentiering vid cell-cellkontakt som myogena celler; alltså i blandade populationer, kan fibroblaster överskridande myogena celler att dominera kulturen.

Fibroblaster har ofta setts som en irritation för muskel biologer, men det finns nu ett växande intresse för fibroblaster som celler värdig studien i sin egen rätt, särskilt som de har visat sig ha en samarbetsvillig roll med myogena celler under muskel reparation ⁶ . Isoleringen och reningen av olika celltyper från människans muskler är därför en viktig metodologisk övervägande när man försöker utreda medfödda beteende båda celltyperna i kultur. Fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS) är en metod genom vilken celler kan sorteras för vidare studier och / eller räknas ochanalyseras. FACS har visat sig tillförlitligt berika mänskliga myogena celler, men utbytet av celler för efterföljande kultur har hittills inte varit hög ^7. Med tanke på den begränsade efterföljare av somatiska celler som satellit cell härledda myogena celler och de mycket fattiga proliferation och differentiering i samband med åldrande ^4, är mer skonsam metoder krävs. Enstaka muskelfiberkulturer erbjuder en annan, mindre aggressiv, innebär att erhålla murina satellitceller fortfarande bosatt i deras sublaminal nisch och efter deras aktivering i kultur ^8,9. Detta är emellertid ofta inte möjligt från human muskelbiopsimaterial (eftersom fibrer kan sällan erhållas från senan till senan) vilket innebär att denna teknik inte kan vara tillgänglig för många forskningslaboratorier intresserade av att studera humana muskelhärledda celler. Dessutom ger den enda fiber tekniken endast mycket begränsat antal cell.

Här beskriver vi ett system för sortering baserad på gentle enzymatisk nedbrytning av celler med användning av kollagenas och dispas följt av två på varandra följande rundor av magnetisk aktiverad cellsortering (MACS) som ger både en hög renhet (> 95% myogena celler) och utbytet (~ 2,8 x 10 ⁶ ± 8,87 x 10 ⁵ celler / g vävnad) för experiment i kultur. CD56 anses vara den gyllene standarden ytan markör för identifiering av mänskliga satellitceller in situ ¹⁰ och in vitro ¹¹ och erbjuder en idealisk ytmarkör kandidat för pärla fastsättning. I detta tillvägagångssätt CD56-antikroppar konjugerade till järnoxid och polysackarid-innehållande superparamagnetiska pärlor är bundna till celler och fick passera genom en höggradient magnetisk cellseparation kolonn placeras i ett starkt magnetfält ^12,13. De separationskolonner är fyllda med en matris av ferromagnetiska stålull eller järnsfärer som tjänar till att fokusera magnetiska fältlinjer mot deras yta genererar starka magnetfält gradienter (~ 4tesla) ¹⁴. I dessa kolumner ens något magnetiska celler attraheras och adsorberas till ytan ^14. Obundet (CD56 ^-) celler passerar genom kolonnen, medan CD56 ⁺ celler märkta med magnetiska mikropärlor behålls tills avlägsnande från magnetfältet ^12,15.

Cellsuspensioner från något skede av sorteringsprocessen kan pläteras på den önskade densiteten för ytterligare experimentering. Efter en given ingripande de cellbeståndsdelar kan identifieras med hjälp av immuncytokemi, avbildas med brett fält eller konfokal fluorescensmikroskopi och analyseras kvantitativt med hjälp av en bildanalys strategi som tillåter snabb objektiv mätning av alla märkta celler i varje given bild. I vårt laboratorium har vi använt denna dubbla immunomagnetisk sorterings inflygning följd av bildanalys ¹⁶ för att visa att CD56 ^– mänskliga fibroblaster lätt transdifferentiera till adipocyter, medan myogena cells av satellit ursprung är mycket resistenta mot denna adipogena omvandling ^5.