The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.
Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.
Gli astrociti sono cellule gliali onnipresenti e abbondanti del cervello. E 'ben noto che gli astrociti servono di sostegno vitale e ruoli omeostatici, tra cui il buffering di K + concentrazione nello spazio extracellulare, l'assorbimento di neurotrasmettitori oltre a fornire le sostanze nutritive. Tuttavia, studi recenti dimostrano che anche la visualizzazione [Ca 2+] i segnali, che si verificano spontaneamente e sono aumentate di attività neuronale 1. L'esistenza di astrociti [Ca 2+] i segnalazione è stata sempre più pensato per innescare la loro comunicazione con i neuroni, e come tale è stato interpretato come una forma di "Ca 2+ eccitabilità" all'interno di astrociti. I dati disponibili nel corso degli ultimi due decenni suggeriscono due ambienti in cui gli astrociti e neuroni possono comunicare, forse in maniera bidirezionale. In primo luogo, gli astrociti spesso rispondono con un aumento della [Ca2 +] i, quando attivato da neurotrasmettitori eneuromodulatori rilasciati dai neuroni 2. In secondo luogo, [Ca 2+] i accresce in astrociti causare il rilascio di molecole di segnalazione da astrociti, che a loro volta possono influenzare i neuroni e vasi sanguigni. L'evidenza suggerisce che molecole rilasciate dagli astrociti portano a cambiamenti nelle funzioni delle sinapsi, circuiti e in ultima analisi il comportamento 3-5 tramite segnalazione astrociti-to-neurone. Tuttavia, questo rimane un settore di ricerca in rapido sviluppo, e si è sostenuto che una migliore e dettagliata comprensione di astrociti [Ca 2+] i è necessaria per risolvere alcune delle attuali incertezze 6.
Nel lavoro passato, è stato dimostrato che grosso carico di organici Ca 2 + indicatore coloranti in astrociti non riesce a rilevare in modo affidabile [Ca 2+] i segnali all'interno intere astrociti in coltura e in situ 7-10. Questi risultati sono stati discussi da noi e altri 6,11,12. Il Emerging quadro è che [Ca 2+] i segnali all'interno dei processi di astrociti (ad esempio, rami e ramoscelli), che sono i siti principali per le interazioni con i neuroni e vasi sanguigni, sono stati raramente esplorato in dettaglio. Recentemente, l'uso di indicatori di calcio geneticamente codificati (GECIS) come GCaMP3 citosolica, GCaMP5G e GCaMP6 e membrana plasmatica versioni tethered (ad esempio, Lck-GCaMP3) ha permesso lo studio di [Ca 2+] i segnali in piccoli scomparti di astrociti tali processi sottili, vicino alla membrana plasmatica ed entro interi territori 7,8. Tuttavia, GECIS hanno uno svantaggio negli organici Ca 2+ indicatore coloranti e che è il requisito per i metodi genetici per fornire i geni che codificano selettivamente ai astrociti in vivo per periodi di settimane per il GECIS di essere adeguatamente espresso. Espressione in vivo è tipicamente realizzato utilizzando topi transgenici, knock-in topi o con virus a base di consegna appscarafaggi. Nel presente articolo Giove riportiamo i metodi e le procedure utilizzate per fornire GECIS di astrociti striatali che utilizzano virus adeno-associati. Facciamo il cito-GCaMP3 come esempio, ma la stessa procedura di base funziona per qualsiasi altra GECI o fluorescenti giornalista base di proteine.
I metodi qui descritti hanno permesso di esprimere cito-GCaMP3 negli astrociti striatali in vivo per la successiva [Ca 2+] i di imaging in situ. Questo metodo presenta vantaggi rispetto utilizzando transgenici o topi knock-in, compreso robusta espressione della proteina bersaglio, rapidità e flessibilità di implementazione sperimentale e specificità anatomica. L'espressione di GCaMP3 utilizzando AAV2 / 5 è risultato essere specifico e robusto. La combinazione di GFAP GfaAB…
The authors have nothing to disclose.
La maggior parte del lavoro e del personale coinvolto sono stati sostenuti dal NIH concedere NS060677 e in parte dal NIH concede MH099559 e MH104069 (a BSK). Una parte del lavoro è stato anche sostenuto dalla Fondazione CHDI.
Syringe Pump | Harvard Apparatus | 704506 | |
Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
Micropipette puller | Narishige | PC-10 | |
Micropipette grinder | Narishige | EG-40 | |
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3 | Addgene | 44331 | a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging |
I mL syringe | BD | 309628 | |
syringe needle | BD | 305109 | |
AAV2/5 virus | UPenn vector core | NA | |
Sudan red IV | Sigma-Aldrich | 67386 | |
Mineral oil | CVS Pharmacy | 152355 | |
Cryostat | Leica | CM3050 S | |
Stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900LS | |
High Speed Rotary Micromotor Kit | FOREDOM | K.1070 | |
Paraformaldehyde | Santa cruz biotechnology | sc-281692 | |
Super Glue | Krazy®Glue | KG925 | |
Microslicer | Ted Pella | DTK-Zero 1 | |
Confocal microscopes | Olympus | FV300 and FV1000 | |
Normal goat serum | Vector | S-1000 | |
chicken anti-GFP | Abcam | ab13970 | |
mouse anti-s100β | Sigma-Aldrich | S2532 | |
mouse anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
mouse anti-glutamine synthetase | Millipore | MAB302 | |
goat anti-mouse-Alexa546 | Invitrogen | A11003 | |
goat anti-chicken-Alexa488 | Invitrogen | A11039 | |
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5J | |
Mounting Medium | Vector | H-1000 |