تقرن تسجيلات خلية كاملة في عضوي شرائح الحصين
Summary
Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.
Abstract
Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.
Introduction
مستقبلات الغلوتامات توسط غالبية انتقال متشابك مثير في نقاط الاشتباك العصبي الجهاز العصبي المركزي. الأنواع الفرعية الرئيسية اثنين من مستقبلات الغلوتامات ionotropic المحلية على رأس العمود الفقري للغشاء بعد المشبكي هي N-ميثيل مد اسبارتاتي (NMDA) وα-أمينو 3 هيدروكسي-5-methylisoxazole-4-proprionic حمض (أمبا) مستقبلات. في إمكانات غشاء يستريح، مستقبلات أمبا تحمل معظم التيار بعد المشبكي أثناء انتقال متشابك. في قرن آمون، ومستقبلات NMDA يلعب دورا رئيسيا في إحداث تغييرات في عدد مستقبلات أمبا في الغشاء بعد المشبكي: من خلال العمل ك "كاشف صدفة" 1 لبدء تغييرات في قوة متشابك 1، يشارك مستقبلات NMDA في آليات متشابك التي يعتقد أنها تدعم التعلم والذاكرة عند مستوى التحت خلوية. ردا على الاستقطاب من عصبون بعد المشبكي بالتوازي مع إطلاق الارسال قبل المشبكي، يدخل الكالسيوم عبر NMDAمستقبلات لبدء أمبا مستقبلات الإدراج أو إزالة 2. هذه الديناميات مستقبلات تكمن وراء المشبك اللدونة: زيادة في قوة متشابك هي على المدى الطويل التقوية 2،3 (LTP)، في حين أن الانخفاض في قوة متشابك طويل الأجل الاكتئاب 4 (LTD). لذا يعتقد حركة مستقبلات أمبا ليكون مسؤولا عن اللدونة متشابك التعبير، في حين يعتقد مستقبلات NMDA للسيطرة على تحريض لها.
تحديد الآليات الدقيقة الكامنة وراء انتقال متشابك واللدونة يتطلب دراسة المجموعات الصغيرة من نقاط الاشتباك العصبي، من الناحية المثالية نقاط الاشتباك العصبي واحدة. في حين أن بعض نقاط الاشتباك العصبي هي مناسبة للغاية للدراسة في هذا المستوى، على سبيل المثال، كاليكس من عقد 5، للسكان الأكثر متشابك هذا أمر صعب للغاية نظرا لطبيعة الصغيرة ومنتشر من الاتصالات متشابك. وقد وضعت اثنين من التقنيات الرئيسية لدراسة الكهربية اتصالات متشابك واحدة: الأول هو الحد الأدنى من التحفيز، وهرالبريد يفترض الألياف قبل المشبكي واحد حفز خارج الخلية. يتم إقران التقنية الثانية التسجيلات، حيث يتم تنفيذ اثنين في وقت واحد التسجيلات خلية كاملة من الخلايا العصبية مرتبطة synaptically. والميزة الرئيسية لأدنى التحفيز هو أنه سريع وبسيط نسبيا لأداء، التي تنطوي على وضع لتحفيز الكهربائي خارج الخلية في الجهاز محور عصبي أثناء تسجيل في وقت واحد من عصبون بعد المشبكي. الشاغل الرئيسي عند استخدام هذه التقنية هو أن التحفيز موثوق بها من خلية واحدة نادرا ما يمكن ضمان المحاكمة بعد المحاكمة.
على مدى السنوات الخمس عشرة الماضية ولقد استخدمت بشكل روتيني تقرن تسجيلات خلية كاملة من اثنين من الخلايا العصبية الهرمية مرتبطة synaptically 6-17. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أن واحدا فقط عصبون قبل المشبكي يتم تحفيز باستمرار وبشكل موثوق. كما يسمح ليس فقط توصيف الكهربية ولكن أيضا التلاعب الدوائية للعصبون قبل المشبكي 6،18 </ سوب>. ومع ذلك، فإن احتمال اتصال متشابك بين الخلايا العصبية منخفضة، مما يجعل أزواج متصلة الصعب الحصول على 19. استخدام عضوي النمط الثقافات شريحة الدماغ تلتف هذه العقبة واتصال متشابك يمكن إعادة إنشاء في المختبر، وعلاوة على ذلك طبيعة الربط الناتجة مماثلة لتلك التي في أنسجة المخ الأم 20. بالإضافة إلى ذلك، الثقافات عضوي النمط تعبر LTP، LTD 7-10،12-15،21 وأشكال إضافية من اللدونة متشابك على المدى القصير بما في ذلك تسهيل إقران النبض (PPF)، والاكتئاب (PPD) 6،22،23، وتمكين آليات اللدونة ل دراستها في أزواج من الخلايا العصبية. نحن هنا وصف منهجية مفصلة المشاركة في تحقيق التسجيلات المقترنة في هذا النظام بنجاح في المختبر. يمكن بسهولة أن تتكيف هذه المعلومات إلى أنظمة تجريبية أخرى، بما في ذلك شرائح الحادة ومناطق أخرى من الدماغ.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا وصفناها متطلبات إنشاء ناجحة تسجيلات خلية كاملة مقترنة عضوي النمط الثقافات شريحة الحصين. ويمكن أيضا أن التسجيلات تقرن أن يؤديها في الاستعدادات متعددة، بما في ذلك شرائح الحادة ونظم الاستزراع فصل 26،27. في حين أن التركيز كان هنا على تحريض أشكال أطول من اللدونة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the members of the Montgomery and Madison labs for helpful discussion. We acknowledge the funding received from the following sources in this research: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC, and NIH.
Materials
| Organotypic cultures | Paired recordings | ||
| Minimum Essential Medium | Stable motorized micromanipulators | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Shallow tissue bath | ||
| HEPES buffer solution | DIC camera | ||
| 1M Tris stock solution | Amplifier | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Computer | ||
| Horse Serum | Vibration isolation table | ||
| plastic-coated miniature spatulas | Upright microscope | ||
| soft paintbrush | Data acquistion and analysis software | ||
| manual tissue chopper | Electrode puller | ||
| #2 filter paper | Faraday cage | ||
| #5 forceps | |||
| Membrane inserts | |||
| CO2 incubator | |||
| Dissection hood | |||
| Class II hood |
References
- Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., Traynelis, S. F. The glutamate receptor ion channels. Pharmacology Reviews. 51, 7-61 (1999).
- Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Long-term potentiation – A decade of progress. Science. 285, 1870-1874 (1999).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. Journal of Physiology. 232, 331-356 (1973).
- Dudek, S. M., Bear, M. F. Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effects of N-methyl-D-aspartate receptor blockade. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 89, 4363-4367 (1992).
- Borst, J. G., Soria van Hoeve, J. The calyx of held synapse: from model synapse to auditory relay. Annual Reviews in Physiology. 74, 199-224 (2012).
- Pavlidis, P., Madison, D. V. Synaptic transmission in pair recordings from CA3 pyramidal cells in organotypic culture. Journal of Neurophysiology. 81, 2787-2797 (1999).
- Pavlidis, P., Montgomery, J. M., Madison, D. V. Presynaptic protein kinase activity supports long-term potentiation at synapses between individual hippocampal neurons. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4497-4505 (2000).
- Montgomery, J. M., Pavlidis, P., Madison, D. V. Pair recordings reveal all-silent synaptic connections and the postsynaptic expression of long-term potentiation. Neuron. 29, 691-701 (2001).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. State-dependent heterogeneity in synaptic depression between pyramidal cell pairs. Neuron. 33, 765-777 (2002).
- Montgomery, J. M., Selcher, J. C., Hansen, J. E., Madison, D. V. Dynamin-dependent NMDAR endocytosis during LTD and its dependence on synaptic state. BMC Neuroscience. 6, 48 (2005).
- Waites, C. L., et al. Synaptic SAP97 isoforms regulate AMPA receptor dynamics and access to presynaptic glutamate. Journal of Neuroscience. 29 (14), 4332-4345 (2009).
- Emond, M., et al. AMPA receptor subunits define properties of state-dependent synaptic plasticity. Journal of Physiology. 588, 1929-1946 (2010).
- Li, D., et al. SAP97 directs NMDA receptor spine targeting and synaptic plasticity. Journal of Physiology. 589, 4491-4510 (2011).
- Genoux, D., Bezerra, P., Montgomery, J. M. Intra-spaced stimulation and protein phosphatase 1 dictate the direction of synaptic plasticity. European Journal of Neuroscience. 33 (10), 1761-1770 (2011).
- Selcher, J. C., Xu, W., Hanson, J. E., Malenka, R. C., Madison, D. V. Glutamate receptor subunit GluA1 is necessary for long-term potentiation and synapse unsilencing, but not long-term depression in mouse hippocampus. Brain Research. 1435, 8-14 (2012).
- Arons, M. H., et al. Autism-associated mutations in ProSAP2/Shank3 impair synaptic transmission and neurexin-neuroligin-mediated transsynaptic signaling. Journal of Neuroscience. 32 (43), 14966-14978 (2012).
- Montgomery, J. M., Madison, D. V. Discrete synaptic states define a major mechanism of synapse plasticity. Trends in Neuroscience. 27 (12), 744-750 (2004).
- Miles, R., Poncer, J. C. Pair recordings from neurones. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 387-394 (1996).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neuroscience. 20 (10), 471-477 (1997).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Paired-pulse facilitation and depression at unitary synapses in rat hippocampus: quantal fluctuation affects subsequent release. Journal of Physiology. 491, 163-176 (1996).
- Debanne, D., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Cooperative interactions in the induction of long-term potentiation and depression of synaptic excitation between hippocampal CA3-CA1 cell pairs in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 93 (20), 11225-11230 (1996).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346 (6280), 177-180 (1990).
- DeBello, W. M., et al. SNAP-mediated protein-protein interactions essential for neurotransmitter release. Nature. 373 (6515), 626-630 (1995).
- Bekkers, J. M., Stevens, C. F. Origin of variability in quantal size in cultured hippocampal neurons and hippocampal slices. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 87, 5359-5362 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations, and LTP. Science. 252, 722-724 (1991).
- Debanne, D., Guérineau, N. C., Gähwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome. Brain Research. 1440, 1-8 (2012).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down’s syndrome. Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).
