Pareadas Grabaciones de células enteras en organotípicos de hipocampo rebanadas
Summary
Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.
Abstract
Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.
Introduction
Los receptores de glutamato median la mayoría de la transmisión sináptica excitadora en las sinapsis del sistema nervioso central. Los dos subtipos principales de receptores ionotrópicos de glutamato localizados en la cabeza de la columna vertebral de la membrana postsináptica son N-metil-D-aspartato (NMDA) y α-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propiónico ácido (AMPA). En reposo los potenciales de membrana, receptores AMPA llevan la mayor parte de la corriente postsináptica durante la transmisión sináptica. En el hipocampo, el receptor de NMDA juega un papel clave en el desencadenamiento de los cambios en el número de receptores AMPA en la membrana postsináptica: al actuar como un "detector de coincidencia" 1 para iniciar los cambios en la fuerza sináptica 1, el receptor de NMDA participa en los mecanismos sinápticos que se cree que subyacen en el aprendizaje y la memoria en un nivel subcelular. En respuesta a la despolarización de la neurona postsináptica en paralelo con la liberación del transmisor presináptica, el calcio entra a través de la NMDAreceptor para iniciar la inserción del receptor de AMPA o extracción 2. Estas dinámicas de los receptores de la plasticidad subyacen sinapsis: un aumento en la fuerza sináptica es la potenciación a 2,3 largo plazo (LTP), mientras que una disminución en la fuerza sináptica es la depresión a largo plazo 4 (LTD). Por lo tanto el movimiento del receptor de AMPA se piensa que es responsable de la expresión de la plasticidad sináptica, mientras que los receptores de NMDA se cree que el control de su inducción.
La determinación de los mecanismos precisos que subyacen a la transmisión sináptica y la plasticidad requiere el estudio de pequeñas poblaciones de sinapsis, idealmente sinapsis individuales. Mientras que algunas sinapsis son muy adecuados para el estudio a este nivel, por ejemplo, el cáliz de Held 5, para las poblaciones más sinápticas esto es extremadamente difícil debido a la naturaleza pequeña y difusa de las conexiones sinápticas. Dos de las principales técnicas de electrofisiología se han desarrollado para examinar las conexiones sinápticas individuales: El primero es la estimulación mínima, where una fibra presináptica se presume estimulada extracelularmente. La segunda técnica se combina grabaciones, donde se lleva a cabo dos grabaciones simultáneas de células enteras de neuronas conectadas sinápticamente. Una ventaja importante de estimulación mínima es que es rápida y relativamente fácil de realizar, que implica la colocación de un electrodo de estimulación extracelular en el tracto axonal mientras que simultáneamente se grabe de una neurona postsináptica. La principal preocupación cuando se utiliza esta técnica es que la estimulación fiable de una única célula rara vez se puede garantizar prueba tras prueba.
Durante los últimos quince años hemos utilizados habitualmente se combina grabaciones de células enteras a partir de dos neuronas piramidales conectados sinápticamente 6-17. La principal ventaja de esta técnica es que sólo una neurona presináptica es estimulada consistente y fiable. También permite no sólo la caracterización electrofisiológica, sino también la manipulación farmacológica de la neurona presináptica 6,18 </ Sup>. Sin embargo, la probabilidad de conectividad sináptica entre neuronas es baja, por lo que los pares conectados difícil obtener 19. El uso de cultivos de cortes de cerebro organotípicos evita este obstáculo como la conectividad sináptica puede volver a establecer in vitro y, además, la naturaleza de la conectividad resultante es similar a la que en el tejido cerebral nativa 20. Además, cultivos organotípicos expresan LTP, LTD 7-10,12-15,21 y otras formas de plasticidad sináptica a corto plazo, incluyendo la facilitación a dos pulsos (PPF) y la depresión (PPD) 6,22,23, lo que permite a los mecanismos de plasticidad ser estudiado en pares de neuronas. Aquí se describe la metodología detallada que participan en la consecución con éxito grabaciones pareadas en este sistema in vitro. Esta información puede ser fácilmente adaptado para otros sistemas experimentales, incluso en lonchas agudas y otras regiones del cerebro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí hemos descrito los requisitos para establecer exitosas grabaciones de células enteras pareadas en cultivos de cortes de hipocampo organotípicos. Grabaciones apareadas también se pueden realizar en múltiples preparaciones, incluso en lonchas agudas y sistemas de cultivo disociadas 26,27. Mientras que el enfoque aquí ha estado en la inducción de formas de plasticidad sináptica (LTP y LTD saber) más largos, es importante destacar que las grabaciones de células enteras pareadas en organotípico, re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank the members of the Montgomery and Madison labs for helpful discussion. We acknowledge the funding received from the following sources in this research: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC, and NIH.
Materials
| Organotypic cultures | Paired recordings | ||
| Minimum Essential Medium | Stable motorized micromanipulators | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Shallow tissue bath | ||
| HEPES buffer solution | DIC camera | ||
| 1M Tris stock solution | Amplifier | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Computer | ||
| Horse Serum | Vibration isolation table | ||
| plastic-coated miniature spatulas | Upright microscope | ||
| soft paintbrush | Data acquistion and analysis software | ||
| manual tissue chopper | Electrode puller | ||
| #2 filter paper | Faraday cage | ||
| #5 forceps | |||
| Membrane inserts | |||
| CO2 incubator | |||
| Dissection hood | |||
| Class II hood |
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