Høy gjennomstrømming analysen til sin fenotype<em> Salmonella ente</em> Typhimurium Association, Invasion, og Replication i makrofager
Summary
En high-throughput analysen til in vitro fenotype Salmonella eller annen bakteriell forening, invasjon, og replikering i fagocyttiske celler med høy gjennomstrømming kapasitet ble utviklet. Metoden ble ansatt for å evaluere Salmonella genet knockout mutante stammer for sine engasjementer i verts-patogen interaksjoner.
Abstract
Salmonella arter er zoonotiske patogener og viktigste årsakene til matbårne sykdommer hos mennesker og husdyr 1. Forstå mekanismene bak Salmonella -host samhandling er viktig å belyse den molekylære patogenesen av Salmonella-infeksjon. Den Gentamicin beskyttelse analysen til fenotype Salmonella forening, invasjon og replikering i fagocyttiske celler ble tilpasset for å tillate høy gjennomstrømming screening for å definere rollene delesjonsmutanter av Salmonella enterica serotype Typhimurium i vert interaksjoner ved hjelp av RAW 264,7 murine makrofager. Under denne protokollen, variansen i målinger er betydelig redusert sammenlignet med standard protokollen, for villtype og mange mutant stammer kan bli testet i samme dyrkningsskål, og på samme tid. Bruken av flerkanalspipetter øker gjennomstrømningen og forbedrer presisjon. Videre bekymringer knyttet til å bruke mindre host celler per brønn i 96-brønners kultur fatet ble adressert. Her protokollen av den modifiserte in vitro Salmonella invasjon assay ved bruk av fagocytiske celler ble med hell anvendt for å fenotype 38 individuelle Salmonella delesjonsmutanter for krets, invasjon og intracellulær replikasjon. In vitro fenotyper er presentert, og noen av disse ble senere bekreftet å ha in vivo fenotyper i en dyremodell. Dermed blir endret, standardisert analysen fenotype Salmonella forening, invasjon og replikering i makrofager med høy gjennomstrømming kapasiteten kunne utnyttes mer generelt for å studere bakteriell-vert interaksjoner.
Introduction
Nontyphoidal Salmonella er viktige årsaker til enteriske sykdommer hos alle virveldyr. Salmonellose hos mennesker er blant de beste bakterielle matbårne sykdommer en. Karakterisering av de molekylære mekanismene som ligger til grunn interaksjoner av Salmonella med sine dyr verter oppnås hovedsakelig gjennom studiet av Salmonella enterica serotype Typhimurium (STM) i vev kultur og dyremodeller av infeksjon. Å få innsikt i STM-vert interaksjoner vil hjelpe oss å forstå hvordan Salmonella overleve og vokse inni vertsceller. Den første utfordringen i å studere disse interaksjonene er å identifisere så mange som deltar faktorer som mulig fra både vert og patogen, men disse bestrebelser er i stor grad hindret av betydelige vanskeligheter med å håndtere to uavhengige komplekse biologiske systemer samtidig, dvs. vert og Salmonella, under fysiologiske betingelser. I tillegg er det store repertoire av Salmonella og verts gener potensielt koder faktorer involvert i vert interaksjoner krever høy gjennomstrømming biologisk plattform for å takle denne utfordringen.
En modifisert, standardisert analysen til fenotype Salmonella forening, invasjon og replikering i makrofager med høy gjennomstrømming kapasitet ble utviklet for å undersøke et stort sett med gener sannsynlig engasjerende i Salmonella -host interaksjoner. Den Gentamicin beskyttelse analysen ble utviklet i 1973 2, men ble først grundig beskrevet av Elsinghorst i 1994 3,4. Det har nå blitt et standardverktøy for å studere mange intracellulære bakterier ex vivo, inkludert Salmonella 5,6. Internalisert bakterier unngå å bli drept av noen antibiotika, som Gentamicin, som ikke kan trenge eukaryote celler tre. Ved å utnytte dette fenomenet, måler Gentamicin beskyttelse analysen overlevelse og vekst av intracellulær bacterial patogener. Tre hendelser i løpet av infeksjon, dvs. tilknytning til eukaryote celler, invasjon og replikering, kan evalueres for intracellulære bakterier basert på tidsintervallet mellom infeksjon, Gentamicin behandling, og videre inkubasjon (figur 1). Eukaryote cellelinjer gir en fysiologisk miljø som er mindre kompleks enn relevante dyremodeller for host-patogen interaksjonsstudier.
Den Gentamicin beskyttelsesbestemmelse som er en egnet plattform for å studere STM-vert interaksjoner, men standard assay i en 24-brønns dyrkningsskål har lav gjennomstrømningskapasitet. Computational analyse av in vivo datasett identifisert 149 Salmonella genprodukter som er anslått til å samhandle med ca 300 verts genprodukter (upubliserte data). Standarden Gentamicin beskyttelsesbestemmelse som ikke har kapasitet til å fenotype dette antall mutanter effektivt.
I addition, kan Gentamicin beskyttelse analysen teoretisk oppdage invasjonen av enda en enkelt bakterie. På grunn av denne iboende følsomhet, rådata er utsatt for tekniske variasjoner når gjentatt på forskjellige tidspunkter. De interne kontroller og relative data presentasjon etter normalisering er avgjørende for meningsfull tolkning av resultatene. Gitt disse betraktninger, ble en modifisert, standardisert Gentamicin beskyttelse assay utviklet for å teste kapasitet og øke presisjon.
Den følgende protokoll er beskrevet og illustrert for å utføre den modifiserte Gentamicin beskyttelsesbestemmelse ved hjelp av 96-brønners kultur-retter og murin makrofag RAW264.7 cellelinje. Sammenlignet med standard protokollen i 24-brønners dyrkingsskåler, har modifisert protokoll de følgende fordeler: 1) Ved bruk av 96-brønners kultur retter tillater opp til 10 forskjellige mutantstammer som skal phenotyped inkludert interne positive og negative kontroller med tilstrekkelig statistisk styrke;2) Variansen resultater er betydelig redusert, fordi de mutantstammer blir testet på samme dyrkningsskål, og på samme tid; 3) Bruk av flerkanalspipetter øker gjennomstrømningen og reduserer tretthet. Til slutt sammenligner til 24-brønns dyrkingsskåler, ble bekymringene mindre verts celler per brønn i 96-brønners dyrkningsskål adressert gjennom protokoll optimalisering og standardisering.
I sammendraget, den modifiserte, standardisert analysen til in vitro fenotype Salmonella eller annen bakteriell forening, invasjon og replikering i fagocyttiske celler øker presisjon og oppnår høy gjennomstrømming kapasitet og reduserer tretthet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den Gentamicin beskyttelsesbestemmelse som er mye brukt for å studere den invasjon og replikasjon av intracellulære bakterielle patogener inne vertscellen, og det er spesielt et viktig verktøy for å studere biologiske patogener, slik som Salmonella, hvis invasjonen er forutsetningen skritt for å etablere en infeksjon. Standarden Gentamicin beskyttelse analysen i Salmonella forskningsmiljøet er implementert i 24-brønns kultur fatet fem. Selv om bruken av 48 eller selv 96-br?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette prosjektet ble delvis støttet av et stipend for National Institutes of Health NIAID (for AJB og LGA, R01 AI076246). Salmonella mutant samlingen ble delvis støttet av National Institutes of Health tilskudd (for MM, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 AI039557-11 og R01 AI075093-01), dels ved National Institutes of Health tilskudd (for HAP, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Vi takker Steffen Prowollik for replika plating og bekrefter mutantene i samlingen.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 cell culture flask vented filter cap | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100X Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353086 | |
| 96-well cell culture plate | Corning Incorporated | 3595 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH7.4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Kanamycin solution | Sigma | K0254 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 |
References
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).
- Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).
- Behlau, I., Miller, S. I. A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells. J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).
- Hueck, C. J., et al. Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins. Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).
- Steele-Mortimer, O. Infection of epithelial cells with Salmonella enterica. Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).
- Foster, J. W., Spector, M. P. How Salmonella survive against the odds. Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).
- Molinari, G., et al. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium. Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).
- Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).
- Lawhon, S. D., et al. Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach. PLoS One. 6, e26869 (2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion. Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).
