High-throughput Assay per Fenotipo<em> Salmonella enterica</em> Typhimurium Associazione, Invasion, e replica nei macrofagi
Summary
Un test high-throughput per fenotipo Salmonella in vitro o di altra associazione batterica, l'invasione, e la replica in fagociti con capacità high-throughput è stato sviluppato. Il metodo è stato impiegato per valutare Salmonella gene knockout ceppi mutanti per il loro coinvolgimento in interazioni ospite-patogeno.
Abstract
Le specie Salmonella sono agenti patogeni zoonotici e principali cause di malattie di origine alimentare negli esseri umani e bestiame 1. La comprensione dei meccanismi alla base delle interazioni Salmonella -host sono importanti per chiarire la patogenesi molecolare di infezione da Salmonella. Il dosaggio di protezione gentamicina a fenotipo associazione Salmonella, l'invasione e la replica in fagociti è stato adattato per consentire lo screening high-throughput per definire i ruoli dei mutanti di delezione di Salmonella enterica sierotipo Typhimurium nelle interazioni host utilizzando RAW 264.7 macrofagi murini. Nell'ambito di questo protocollo, la varianza nelle misurazioni è significativamente ridotto rispetto al protocollo standard, perché wild-type e più ceppi mutanti possono essere testati nello stesso piatto di cultura e, allo stesso tempo. L'uso di pipette multicanale aumenta la produttività e migliora la precisione. Inoltre, le preoccupazioni relative a usare meno host cellule per pozzetto in 96-ben piatto cultura sono stati affrontati. Qui, il protocollo della vitro Salmonella invasione test modificati utilizzando fagociti è stato impiegato con successo per fenotipo 38 singoli mutanti di delezione Salmonella per l'associazione, l'invasione e la replica intracellulare. I fenotipi in vitro sono presentati, alcuni dei quali sono stati successivamente confermato di avere in fenotipi vivo in un modello animale. Pertanto, la modifica, test standardizzato per fenotipo Salmonella associazione, l'invasione e la replica nei macrofagi con capacità high-throughput potrebbe essere utilizzato più ampiamente per studiare le interazioni batteri-ospite.
Introduction
Salmonella non tifoidi sono importanti cause di malattie enteriche in tutti i vertebrati. Salmonellosi nell'uomo è tra le prime malattie di origine alimentare batterica 1. Caratterizzazione dei meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni di Salmonella con i loro host di origine animale è ottenuta principalmente attraverso lo studio di Salmonella enterica sierotipo Typhimurium (STM) in colture di tessuti e modelli animali di infezione. Guadagnando intuizioni nelle interazioni STM-ospite ci aiuterà a capire come Salmonella sopravvivere e crescere all'interno di cellule ospiti. La prima sfida nello studio di queste interazioni è quello di identificare il maggior numero possibile di fattori che partecipano sia da ospite e patogeno, ma questi sforzi sono in gran parte ostacolato dalle notevoli difficoltà di trattare con due sistemi biologici complessi indipendenti simultaneamente, vale a dire, di accoglienza e di Salmonella, in condizioni fisiologiche. Inoltre, la grande repertoOire di Salmonella e geni ospitanti potenzialmente codificanti fattori coinvolti in interazioni ospite necessitano di high-throughput piattaforma biologico per affrontare questa sfida.
Un modificato, test standardizzato per fenotipo associazione Salmonella, l'invasione e la replica nei macrofagi con capacità high-throughput è stato sviluppato per esaminare un ampio set di geni probabilmente impegnati in interazioni Salmonella -host. Il saggio di protezione gentamicina è stato sviluppato nel 1973 2, ma è stato accuratamente descritto da Elsinghorst nel 1994 3,4. Ora è diventato uno strumento standard per lo studio di molti batteri patogeni intracellulari ex vivo, tra cui Salmonella 5,6. Batteri internalizzati evitare di essere ucciso da alcuni antibiotici, come la gentamicina, che non possono penetrare le cellule eucariotiche 3. Sfruttando questo fenomeno, il saggio protezione Gentamicina misura la sopravvivenza e la crescita di ba intracellularepatogeni cterial. Tre eventi durante l'infezione, cioè, l'associazione con le cellule eucarioti, l'invasione e la replica, possono essere valutati per batteri patogeni intracellulari in base l'intervallo di tempo tra l'infezione, il trattamento Gentamicina, e in seguito di incubazione (Figura 1). Linee di cellule eucariotiche forniscono un ambiente fisiologico che è meno complessa di modelli animali per studi di interazione ospite-patogeno.
Il test di protezione gentamicina è una piattaforma appropriata per studiare le interazioni STM-ospite, ma il test standard in un piatto di coltura 24 pozzetti num bassa velocità. Analisi computazionale dei set di dati in vivo identificato 149 prodotti genici Salmonella che si prevede di interagire con circa 300 prodotti genici ospite (dati non pubblicati). Il test di protezione gentamicina standard non ha la capacità di fenotipo questo numero di mutanti in modo efficiente.
In Additione, il saggio di protezione Gentamicina può teoricamente rilevare l'invasione di anche un singolo batterio. A causa di questa sensibilità intrinseca, i dati grezzi sono suscettibili di variazioni tecniche quando ripetuto in tempi diversi. I controlli interni e la presentazione dei dati relativi dopo la normalizzazione sono essenziali per l'interpretazione significativa dei risultati. Alla luce di queste considerazioni, una versione modificata, standardizzato test di protezione gentamicina è stato sviluppato per migliorare la capacità di test e aumentare la precisione.
Il protocollo seguito è dettagliata e illustrata per eseguire il test di protezione Gentamicina modificato utilizzando 96 pozzetti piatti della cultura e la linea cellulare di macrofagi RAW264.7 murino. Rispetto al protocollo standard a 24 pozzetti piastre di coltura, il protocollo modificato presenta i seguenti vantaggi: 1) Uso di 96 pozzetti piatti della cultura permette fino a 10 diversi ceppi mutanti per essere phenotyped compresi i controlli interni positivi e negativi con potenza statistica sufficiente;2) La varianza dei risultati è notevolmente ridotta, in quanto i ceppi mutanti vengono testate nello stesso piatto cultura e allo stesso tempo; 3) L'uso di pipette multicanale aumenta il throughput riducendo la fatica dell'operatore. Infine, il confronto a 24 pozzetti piastre di coltura, le preoccupazioni di meno cellule ospiti per pozzetto a 96-ben piatto cultura sono state affrontate attraverso l'ottimizzazione e la standardizzazione del protocollo.
In sintesi, la modifica, test standardizzato per vitro fenotipo Salmonella o altra associazione batterica, l'invasione e la replica in fagociti aumenta la precisione e raggiunge la capacità high-throughput riducendo la fatica dell'operatore.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il test di protezione gentamicina è ampiamente usato per studiare l'invasione e la replica di batteri patogeni intracellulari all'interno della cellula ospite, ed è soprattutto un importante strumento biologico per lo studio di agenti patogeni, come la Salmonella, la cui invasione è il passo presupposto indispensabile per l'infezione 1. La protezione dosaggio standard di gentamicina nella comunità di ricerca di Salmonella è implementato in 24-ben piatto cultura 5.…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato sostenuto in parte da una sovvenzione per i National Institutes of Health NIAID (per AJB e LGA, R01 AI076246). La collezione mutante di Salmonella è stato in parte sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni (per MM, U01 A152237-05, R01, R01 AI07397-01 AI039557-11 e R01 AI075093-01), in parte dal National Institutes of Health sovvenzioni (per HAP, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Ringraziamo Steffen Prowollik per la placcatura replica e confermando i mutanti della collezione.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 cell culture flask vented filter cap | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100X Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353086 | |
| 96-well cell culture plate | Corning Incorporated | 3595 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH7.4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Kanamycin solution | Sigma | K0254 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 |
References
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).
- Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).
- Behlau, I., Miller, S. I. A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells. J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).
- Hueck, C. J., et al. Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins. Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).
- Steele-Mortimer, O. Infection of epithelial cells with Salmonella enterica. Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).
- Foster, J. W., Spector, M. P. How Salmonella survive against the odds. Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).
- Molinari, G., et al. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium. Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).
- Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).
- Lawhon, S. D., et al. Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach. PLoS One. 6, e26869 (2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion. Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).
