Summary

Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

Published: July 09, 2014
doi:

Summary

Ein Verfahren, um die Fähigkeit der isolierten Maus-Alveolarmakrophagen, um das Wachstum von phagozytierten Aspergillus-Sporen durch konfokale Mikroskopie Steuerung auszuwerten.

Abstract

Die Lunge ist eine Schnittstelle, wo Wirtszellen werden routinemäßig an Mikroben und mikrobielle Produkte ausgesetzt. Alveolarmakrophagen sind die First-Line-Fresszellen, die eingeatmeten Pilzen und anderen Mikroben zu begegnen. Makrophagen und anderen Immunzellen erkennen Aspergillus Motive durch Erreger Erkennungsrezeptoren und nachgeschalteten Entzündungsreaktionen auslösen. Die Phagozyten NADPH-Oxidase erzeugt reaktive Sauerstoff-Intermediate (ROIs) und ist entscheidend für die Immunabwehr. Obwohl NADPH-Oxidase ist für neutrophile Granulozyten vermittelten Wirtsabwehr werden 1 – 3, die Bedeutung der NADPH-Oxidase in Makrophagen nicht gut definiert ist. Das Ziel dieser Studie war es, die spezifische Rolle der NADPH-Oxidase in Makrophagen bei der Vermittlung der Immunabwehr gegen A. abzugrenzen fumigatus. Wir fanden, dass NADPH-Oxidase in Alveolarmakrophagen steuert das Wachstum von phagozytierten A. fumigatus Sporen 4. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die Bewertung der Fähigkeit von Maus-alveolar Makrophagen (AMS), das Wachstum der Phagozytose Aspergillus-Sporen (Konidien) zu steuern. Alveoläre Makrophagen in vivo gefärbt und zehn Tage später aus Mäusen isoliert durch Lavage (BAL). Makrophagen werden auf Deckgläschen überzogen, dann mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP)-exprimierenden A. ausgesät fumigatus Sporen. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden die Zellen fixiert und die Anzahl der intakten Makrophagen phagozytierten Sporen durch konfokale Mikroskopie untersucht.

Introduction

Alveolarmakrophagen sind die First-Line-Fresszellen, die eingeatmete Keime begegnen. Makrophagen erkennen Aspergillus Motive durch Erreger Erkennungsrezeptoren, aufnehmen und das Wachstum von inhalierten Sporen (Konidien) zu begrenzen, und Entzündungsreaktionen auslösen. Phagozyten NADPH-Oxidase wandelt molekularen Sauerstoff in Superoxid-Anion und stromabwärts reaktiven Sauerstoffzwischenprodukte (ROI). Chronische Granulomatose (CGD) ist eine erbliche Erkrankung der NADPH-Oxidase, die durch schwere bakterielle und Pilzinfektionen und durch übermäßige Entzündungsreaktionen.

Obwohl NADPH-Oxidase ist für neutrophile Granulozyten vermittelten Wirtsabwehr werden 1 – 3, die Bedeutung der NADPH-Oxidase in Makrophagen nicht gut definiert ist. Frühere Studien haben gezeigt, dass Alveolarmakrophagen aufnehmen und töten Aspergillus-Sporen, während Neutrophilen hauptsächlich gezielt die Hyphen Stufe 5. Jedoch gibt es widersprüchliche Results in Bezug auf die Rolle der NADPH-Oxidase in Makrophagen bei der Kontrolle des Wachstums von A. fumigatus Sporen 6, 7.

Das Ziel dieser Methode war, die spezifische Rolle der NADPH-Oxidase in Makrophagen bei der Vermittlung der Wirtsabwehr gegen A. abzugrenzen fumigatus Sporen. Wir fanden, dass NADPH-Oxidase in Alveolarmakrophagen steuert das Wachstum von phagozytierten A. fumigatus Sporen 4. Um am nächsten modellieren die Wirtsreaktion auf inhalierte Pilze, verwendeten wir Alveolarmakrophagen von BAL geerntet von nicht-stimulierten Mäusen unmittelbar nach der Tötung. Die Verwendung von isolierten alveolaren Makrophagen konnten wir auf ihre fungizide Aktivität in der Abwesenheit von anderen Immunzellen (zB rekrutierten Neutrophile), die gegen Aspergillus verteidigen in vivo zu konzentrieren. In diesem Verfahren wurden Alveolarmakrophagen in vivo vor gefärbt, um so zu ernten, um die Menge der nach der Ernte Manipulation zu minimieren. </ P>

Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung eines GFP-exprimierenden A. fumigatus-Stamm. Dieser Pilz drückt GFP aus der Konidienstadium durch die Hyphen-Bühne und hat keine Notwendigkeit für eine weitere Färbung. Um Bilder mit mehr Details zu erhalten, entschieden wir uns für die konfokale Mikroskopie, die die Rekonstruktion der dreidimensionalen Strukturen der erhaltenen Bilder ermöglicht. Dreidimensionale Rekonstruktion die Möglichkeit gibt, zwischen Hyphen herum wachsen und nicht in oder durch einen Makrophagen zu differenzieren. Konidien können auch genau unterschieden als intrazelluläre gegenüber extrazellulären sein.

Protocol

Alle Verfahren an Tieren in dieser Studie durchgeführt wurden, von der Animal Care und Verwenden Ausschuss am Roswell Park Cancer Institute genehmigt und mit allen Landes-, Bundes eingehalten werden, und National Institutes of Health Vorschriften. 1. In-vivo-Makrophagen-Labeling Hinweis: PHK26 ein lipophiler Farbstoff, der von phagozytierenden Zellen sowohl in Umlauf und in den Geweben, wenn sie intravenös (iv) verabreicht genommen wird. PKH26 wurde für…

Representative Results

Sammeln Alveolarmakrophagen von BAL aus nicht-stimulierten Mäusen wird in einem> 95% reine Population basierend auf Zytologie führen. Die 3 und 7 h (Abbildung 2) Zeitpunkten gehen der Hyphen-Phase des Pilzwachstum und damit für einen Vergleich der Effizienz der phagocytic Konidien unter Genotypen. Die 14 Stunden Zeitpunkt, wo Genotypen hinsichtlich der Fähigkeit, den Übergang von phagozytierten Konidien zum Gewebe-invasive Hyphen Stufe (Fig. 3) zu inhibieren, verglichen we…

Discussion

Unter Verwendung dieses Ansatzes für die ex vivo Analyse der Antipilz-Aktivität der Makrophagen in vivo zusammen mit Pilz Herausforderung, die wir früher gezeigt, dass NADPH-Oxidase in Makrophagen spielen eine wichtige Rolle bei der Abwehr gegen A. 4 fumigatus. Die Verwendung von isolierten Alveolarmakrophagen ermöglicht es uns, auf ihre fungizide Aktivität in der Abwesenheit von anderen Immunzellen (zB rekrutierten Neutrophile), die gegen Aspergillus verteidi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der National Institute of Allergy and Infectious Disease Zuschuss R01AI079253 (BHS) unterstützt und von der National Cancer Institute Cancer Center Support Grants CA016056 nach Roswell Park Cancer Institute.

Materials

PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling Sigma PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol Sigma T48402 Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol Sigma A-1685 Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) Corning 21-031-CV
NH4CL Sigma A0171 Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3 Sigma P91444 Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA Sigma E6758 Used to make ACK red cell lysis buffer
22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter BD  381523 Insyte Autoguard Winged
insulin syringes
6 ml syringes
4-way stopcock Fisher Scientific 50-700-077
suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine Corning 10-040-CV
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30396.03 heat inactivated
Hema 3 Stain Set Fisher Scientific 22-122-911
Cytoseal 60 Thermo Scientific 8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants BD  297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 micron Cell Strainers BD Falcon 64753-00
scissors
forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge Thermo Scientific
Cell Culture Incubator 37 °C, 5%  CO2
22X22 mm micro cover glass VWR 48366-227 glass coverslips
6 well Cell Culture Plates Corning 3506
10% Neutral Buffered Formalin VWR BDH0502-1LP
Vectashield Mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope

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Cite This Article
Grimm, M. J., D’Auria, A. C., Segal, B. H. Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (89), e51678, doi:10.3791/51678 (2014).

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