L'essai de mobilisation du calcium par fluorescence ici décrit est un système de criblage inverse pharmacologie à débit moyen pour l'identification de ligand (s) d'activation fonctionnellement G orphelins de récepteurs couplés aux protéines (RCPG).
Depuis plus de 20 ans, la pharmacologie inverse a été la stratégie par excellence pour découvrir les ligands activateurs des orphelins G récepteurs couplés aux protéines (RCPG). Le début d'un essai de pharmacologie inverse est le clonage et la transfection ultérieure d'un GPCR d'intérêt dans un système d'expression cellulaire. Le récepteur hétérologue exprimé est alors provoqué avec une bibliothèque de composés de ligands candidats pour identifier le ligand (s) récepteur d'activation. L'activation du récepteur peut être évaluée en mesurant les variations de concentration de deuxième messager molécules rapporteurs, tels que le calcium ou l'AMPc. Le calcium dosage de mobilisation à base de fluorescence décrit ici est un débit moyen fréquemment utilisé inverse essai de pharmacologie. Le GPCR orphelin est exprimée de manière transitoire dans le rein embryonnaire humain 293T (HEK293T) des cellules et une promiscuité Ga 16 construction est co-transfecté. À la suite de la liaison du ligand, l'activation de la sous-unité Ga 16 induit la libération de calcium felon le réticulum endoplasmique. Avant le dépistage de ligand, les cellules exprimant le récepteur sont chargés avec un indicateur de calcium fluorescent, Fluo-4 acétoxyméthyle. Le signal de fluorescence du Fluo-4 est négligeable dans des cellules dans des conditions de repos, mais peut être amplifié plus d'un facteur 100 de l'interaction avec les ions de calcium qui sont libérés après l'activation du récepteur. La technique décrite ne nécessite pas la mise en place de temps de lignées cellulaires transfectées de manière stable dans lequel le matériau génétique transfecté est intégré dans le génome de la cellule hôte. Au lieu de cela, une transfection transitoire, la génération de l'expression temporaire du gène cible, est suffisante pour effectuer l'essai de criblage. L'installation permet le criblage moyen débit de centaines de composés. La co-transfection de la promiscuité Ga 16, qui relie à la plupart des GPCR, permet la voie de signalisation intracellulaire pour être redirigé vers la libération de calcium, indépendamment de la voie de signalisation natif dans Param endogèneréunions. Les cellules HEK293T sont faciles à manipuler et ont prouvé leur efficacité au fil des ans dans des tests de récepteurs deorphanization. Cependant, l'optimisation du dosage des récepteurs spécifiques peut rester nécessaire.
G récepteurs couplés aux protéines (RCPG) constituent l'une des familles les plus importantes et les plus diversifiées entre toutes les protéines de surface cellulaire. Leur présence dans les vertébrés, les invertébrés, les plantes, la levure et moisissure visqueuse, ainsi que dans les protozoaires et les premiers métazoaires diploblastiques indique que les RCPG sont parmi les molécules les plus anciennes liées à la transduction du signal 1. Leurs ligands naturels d'activation comprennent une large diversité de stimuli externes, y compris des peptides, des amines biogènes, des agents odorants, des glycoprotéines, et des photons 2. En tant que tels, ces systèmes de signalisation du récepteur-ligand sont impliquées dans un grand nombre de processus physiologiques. Le large spectre fonctionnel rend idéalement adapté pour le développement de médicaments thérapeutiques qui couvrent un large éventail de maladies humaines. Environ 50-60% des cibles de médicaments courants sont représentés par les RCPG 3,4. Outre leur grande importance dans l'industrie pharmaceutique, les RCPG sont également à l'honneur pour le développement d'unnouvelle génération d'insecticides spécifiques aux espèces 5,6 et pesticides en général. Parce que les ligands naturels de nombreux RCPG sont encore non identifié, ils sont classés comme RCPG orphelins. Le deorphanization de ces récepteurs permettra d'améliorer la compréhension de leurs rôles physiologiques dans les organismes et peut découvrir des cibles potentielles pour de nouveaux médicaments 7.
Depuis l'ère de la génomique, la stratégie de la pharmacologie inverse est largement appliquée pour la deorphanization des RCPG 8. L'approche implique qu'un récepteur orphelin est utilisé comme un «crochet» à «poisson hors 'de son ligand activant à partir d'un extrait biologique ou à partir d'une bibliothèque de composés synthétiques. Le GPCR d'intérêt est clone et donc ensuite transfecté dans un système d'expression cellulaire. Dans les procédés les plus couramment utilisés, l'activation du récepteur est déterminée par mesure des changements dans la concentration de molécules de deuxième messager 9 </sup>. Les principaux tests de criblage de récepteur comptent sur les protéines bioluminescentes sensibles au calcium (par exemple, l'aequorine) 10 ou des indicateurs de calcium fluorescent (par exemple, Fluo-4) 11. Les analyses basées sur la fluorescence, dans laquelle les cellules exprimant le récepteur sont chargés avec un indicateur de calcium fluorescent avant le criblage de ligands, présentent l'avantage qu'elles permettent le criblage à haut débit en raison de leur facilité d'utilisation, peu de temps de lecture, et la flexibilité de dépistage plusieurs récepteurs orphelins sur une seule plaque 12.
Ici, le calcium dosage de mobilisation à base de fluorescence est bien décrite et illustrée par le processus de deorphanization de la Drosophila melanogaster court neuropeptide F (SNPF) récepteur. Ce système de signalisation de neuropeptidergiques a été initialement caractérisée par Mertens et al. en 2002 avec un 13 dosage par bioluminescence de calcium effectué dans ovaire de hamster chinois (CHO)14 et par Feng et al., En 2003 avec un test électrophysiologique utilisant ovocytes de Xenopus 15. La présence du système de signalisation PFNP semble se limiter à l'embranchement des arthropodes de, où il est impliqué dans un large éventail de processus, y compris la réglementation de l'alimentation, la croissance, les réactions de stress, la locomotion et les rythmes circadiens 16.
La recherche sur les systèmes de signalisation neuropeptidergiques chez les insectes ne peut que conduire à de nouvelles cibles pour le développement des insecticides, mais la connaissance de leur fonctionnement peut aussi être extrapolée vers d'autres organismes comme de nombreux systèmes de signalisation ont été généralement bien conservées tout au long de l'évolution 17. Dans la dernière décennie, de grands progrès ont été accomplis dans le processus de deorphanization des RCPG de neuropeptides insectes. En dépit de ces efforts, seul un petit nombre de récepteurs ont été appariés à leur ligand apparenté, et de charges de l'information de séquence pournouveaux RCPG orphelins est devenu disponible en raison de l'essor de la génomique 18. La disponibilité du / des approches de criblage à haut débit, comme le moyen de mobilisation du calcium de l'essai à base de fluorescence qui s'est avérée être une technique largement appliqué 9,18, est donc indispensable.
L'essai de mobilisation du calcium en fonction de la fluorescence telle que décrite ici est réalisée dans le rein embryonnaire humain 293T (HEK293T) de la lignée cellulaire et utilise une sonde fluorescente pour déterminer les changements dans les concentrations intracellulaires de calcium lors de l'activation du récepteur. Afin de garantir des niveaux de récepteur traduction est une expression élevée et, une séquence consensus de Kozak 19 est ajouté à l'extrémité 5 'de la séquence du récepteur de codage, qui est ensuite clone dans un vecteur d'expression (par exemple pcDNA série de vecteur pour des lignées de cellules de mammifères). Comme il est difficile de prédire le couplage à la protéine G endogène d'un GPCR orphelin à partir des informations séquenceseul, les molécules de second messagers (par exemple, de calcium ou AMPc) qui sont modulés après l'activation du récepteur restent souvent inconnus avant l'identification de ligands. Pour contourner ce problème, les protéines G de promiscuité de la famille q G (par exemple, murin Ga Ga 15 ou 16 humain [utilisé ici]) ou des protéines chimères G (par exemple, Ga qi5) qui interagissent avec la plupart des RCPG et induisent la libération de calcium peut être co-exprimés 20,21,22. Lors de la liaison du ligand à son récepteur, le GPCR subit un changement de conformation qui conduit à l'activation des voies intracellulaires spécifiques. La molécule de guanosine diphosphate (GDP), lié dans des conditions de repos à la sous-unité Ga 16, sera remplacé par une guanosine triphosphate (GTP) de molécule. Ceci provoque la dissociation de la protéine G hétérotrimériques dans une Ga et 16 sous-unités Gßy. La sous-unité Ga 16 active la phospholipase C &# 946; (PLCβ), qui à son tour hydrolyse le phosphatidylinositol bisphosphate liée à la membrane (PIP 2) résultant en diacylglycérol (DAG) et l'inositol triphosphate (IP3). IP 3 se propage dans tout le cytoplasme et active les canaux calciques de PI 3-dépendants présents dans la membrane du reticulum endoplasmique, ce qui induit la libération de calcium dans le cytoplasme.
La libération de calcium lors de l'activation du récepteur a lieu en quelques secondes et peut être détecté par le chargement des cellules avant l'essai de dépistage avec un colorant sensible au calcium, Fluo-4 comme acétoxyméthyle (AM) 11. Le groupe ester AM permet au fluorophore de traverser la membrane cellulaire et est clivé par des estérases cytoplasmiques une fois à l'intérieur de la cellule. Par conséquent, les charges négatives du colorant fluorescent sont démasqués, l'empêchant de se diffuser hors de la cellule et lui permettant d'interagir avec les ions calcium. Le signal fluorescent of Fluo-4 est négligeable dans les cellules sous des conditions de repos ne contenant que des concentrations de calcium dans la plage nanomolaire. Toutefois, lorsque le calcium est libéré lors de l'activation du récepteur, le signal peut augmenter la concentration-dépendante de plus d'un facteur 100, en veillant à la présente un grand rapport signal-sur-bruit. Fluo-4 présente également une grande dynamique de rapports [calcium] autour d'un K d (calcium) de 345 nM, ce qui convient pour mesurer les changements de calcium physiologiquement pertinents dans une large gamme de cellules. L'excitation de Fluo-4 se produit à 488 nm et la fluorescence d'émission est mesurée à 525 nm 11. Fluorimètres comme le lecteur de plaque d'imagerie de fluorescence (FLIPR) 23, le NOVOSTAR, ou la FlexStation (dispositif de la station) 12 sont / systèmes à haut débit moyennes qui permettent plus de composé simultanée et la détection du signal Fluo-4 lors de l'activation du récepteur pour chaque bien en une plaque d'essai. L'essai de mobilisation du calcium décrite ici repose sur la stationdispositif système de microplaques de 96 puits.
Le logiciel SoftMax Pro (logiciel) est utilisé pour faire fonctionner le dispositif de station ainsi que pour l'analyse des données. Le programme affiche immédiatement les résultats sous forme de graphiques au format 96 puits. Puits multiples peuvent être sélectionnés en même temps à comparer les résultats de ces puits sur le même graphique. L'unité de fluorescence relative (RFU) valeurs de puits dans chaque colonne sont mesurées simultanément pendant une période de deux minutes, en commençant avant l'addition de composés dans les puits et en continuant après la mesure du signal de fluorescence suite à l'activation du récepteur. En général, la tendance d'une courbe d'agoniste s'aligne avec la ligne de base jusqu'à ce qu'un composé d'activation est ajouté aux cellules, ce qui entraîne une augmentation rapide du signal fluorescent. La hauteur du pic est en corrélation avec la concentration de l'agoniste finale dans le puits. Après le pic, le signal fluorescent descend lentement vers le niveau de base. La mesure de RFU can convertir en courbes concentration-réponse pour déterminer la valeur CE50 (concentration efficace demi-maximale) d'un ligand. En général, au moins trois écrans indépendants, chacun comprenant trois répliques d'une série de concentrations, doivent être réalisées pour composer une courbe concentration-réponse fiable.
Il est recommandé d'inclure plusieurs témoins positifs et négatifs dans la conception expérimentale. Tout d'abord, un contrôle de la transfection, à savoir la mise en oeuvre d'un récepteur avec un ligand connu, doit être testé. Ceci permet de vérifier si l'agent de transfection était opérationnel. L'incorporation d'une expérience témoin avec un agoniste pour un récepteur endogène de la lignée cellulaire et un témoin négatif (par exemple, un tampon de lavage) sont également recommandés pour surveiller la santé et de la viabilité des cellules et à exclure la possibilité que la mémoire tampon de lavage a été contaminé par un facteur qui pourrait provoquer une auto-fluoreréponse de parfum. Agonistes fréquemment utilisés sont un peptide dérivé de la protease-activated receptor-1 (PAR 1), qui agit comme un agoniste de PAR 1 sélectif, le carbachol ou, ce qui active le récepteur de l'acétylcholine. Les cellules transfectées avec un vecteur d'expression vide devraient également être testés pour exclure que les composés actifs interagissent avec les récepteurs endogènes de la cellule. Optimisation de plusieurs paramètres décrits dans le protocole ci-dessous peut être nécessaire pour des systèmes de signalisation différents. Une figure schématique de l'essai complet calcium mobilisation basée sur la fluorescence est représenté dans la figure 1.
Figure 1. Schéma d'ensemble du calcium dosage de mobilisation à base de fluorescence. Automatisé de manipulation de liquide et de fluorescence simultanée mesures sont effectuées avec la stationlecteur de microplaques de l'appareil, entraîné par le logiciel. Le dispositif de station contient trois tiroirs: un pour la plaque de cellule, plaque composé et pointe rack. Les composés d'une colonne de la plaque de composé à la colonne correspondante de la plaque de cellule (étape 1) transfère des pipettes de build-in. Chaque puits de la plaque de cellule contient une monocouche de cellules HEK293T qui ont été co-transfectées avec le GPCR d'intérêt et de la sous-unité 16 Ga promiscuous. Quand un composé active le récepteur, le PIB Ga 16 lié est remplacé par GTP. La sous-unité Ga 16 dissocie ensuite à partir du complexe Gßy et active la phospholipase Cß (PLCβ), qui à son tour hydrolyse le phosphatidylinositol bisphosphate (PIP2) en diacylglycérol résultant (DAG) et l'inositol triphosphate (IP3). IP IP 3 active les canaux calciques dépendant trois présents dans la membrane du reticulum endoplasmique, l'induction de la libération d'int de calciumo le cytoplasme. L'interaction de calcium avec du Fluo-4 (avec lequel les cellules sont chargées avant addition du composé) se traduit par un signal fluorescent (étape 2). Le logiciel présente les résultats sous forme de l'unité de fluorescence relative (RFU) des valeurs en fonction du temps, et la hauteur des pics en corrélation avec la concentration de ligand d'une manière dépendante de la concentration. Ces données peuvent ensuite être convertis en une courbe concentration-réponse pour déterminer la valeur CE 50 d'une paire ligand-récepteur (étape 3).
L'essai de mobilisation du calcium en fonction de la fluorescence a été appliquée avec succès pour confirmer la caractérisation fonctionnelle du système de signalisation de peptidergic PFNP Drosophila, qui a été déjà réalisé par Mertens et al. avec un dosage de bioluminescence et par Feng et al. avec un test 13,15 électrophysiologique. Les CE 50 valeurs obtenues avec le test de fluorescence dans les cellules HEK293T sont environ 10 fois inférieurs à ceux obtenus avec le dosage de bioluminescence effectué dans des cellules CHO (Drôme-PFNP-1: fluo = 2,04 nM, lumi = 51 nM; Drôme-PFNP- 2: fluo = 5,89 nM, lumi = 42 nM; Drôme-PFNP-3: fluo = 5,55 nM, lumi = 31 nM; Drôme-PFNP-4: fluo = 0,50 nM, lumi = 75 nM). Ces variations peuvent s'expliquer par plusieurs facteurs, notamment le fait que l'un des systèmes d'expression utilisés peut être mieux adapté pour l'expression fonctionnelle d'un récepteur donné, ou le pliage de certains récepteurs peut être moins efficace en ctypes de cellules ertaines. Les valeurs de CE50 de l'ensemble des quatre peptides Drome-PFNP sont dans la gamme nanomolaire lorsqu'ils sont testés sur leur récepteur avec à la fois la fluorescence et l'analyse par bioluminescence, supportant généralement la pertinence physiologique de l'interaction peptide-récepteur in vivo.
Notez que pas de contrôle de transfection avec un récepteur pour lequel le ligand activant est connu a été inclus dans l'écran présenté ici, parce que le système de signalisation Drosophila PFNP est normalement le contrôle de transfection dans des configurations expérimentales. Le contrôle positif avec un ligand endogène des cellules HEK293T (PAR 1) et le témoin négatif (tampon de lavage) ont été inclus dans l'écran. Les résultats de PAR 1 ont montré que les cellules étaient en bon état. Le contrôle négatif (tampon de lavage) n'a pas suscité un signal fluorescent, qui indique que le milieu dans lequel les peptides sont dissous était libre de tout contaminant qui pourrait Influence les résultats.
Le système de signalisation Drosophila PFNP caractérisé précédemment a été utilisé ici pour expliquer le dosage de mobilisation du calcium à base de fluorescence. A cet effet, des séries de concentration des ligands activateurs ont été testés immédiatement. Cependant, quand un récepteur orphelin est porté à une surexpression dans un essai de criblage pour tester d'une bibliothèque contenant des centaines de composés, il est recommandé au premier écran avec des concentrations finales relativement élevées des ligands (par ex., 10 ou 1 um). À la suite de la détection d'un composé d'activation, une série de dilutions de composé qui peut être criblée afin de composer une courbe concentration-réponse et pour déterminer la valeur CE 50.
Une fois que le ligand d'un récepteur d'activation est déterminée, la voie de signalisation intracellulaire peut être étudiée plus en adaptant le protocole. Le dosage peut être effectué comme décrit ci-dessus, mais sans co-transfection de la G ^5, 16 sous-unités. Lorsqu'une réponse de calcium est mesurée, cela signifie que les couples récepteur avec une sous-unité Ga q endogène du système d'expression cellulaire. Si aucun signal fluorescent est observée, les protocoles pour mesurer les changements dans les concentrations d'autres messagers secondaires (p. ex., AMPc) peuvent être appliquées.
Relation structure-activité (SAR) études peuvent également être réalisées afin de définir la séquence de base du peptide nécessaire pour l'activation du récepteur. Premièrement, des séquences tronquées sont évalués pour définir la séquence d'acides aminés du peptide minimal qui est encore capable d'activer le récepteur. Ensuite, les peptides peuvent être testés dans lequel systématiquement chaque acide aminé a été remplacé par un résidu alanine. Test de série synthétique alanine-substitution sur le récepteur permet de déterminer l'importance de chacun des acides aminés pour l'activation du récepteur 24,25.
Malgré son utilisation fréquente et efficacité prouvéescacité, il doit être souligné que l'essai décrit ici peut avoir besoin de quelques adaptations pour obtenir des résultats optimaux pour les récepteurs spécifiques d'intérêt. La sous-unité Ga 16 a l'avantage qu'il se lie à la plupart des GPCR, mais peut également avoir un effet dominant-négatif sur les récepteurs qui endogène par l'intermédiaire de deux q Ga 22. Dans ce cas, il peut être utile de tester différentes combinaisons de protéines G au cours de l'optimisation d'un nouveau dosage de calcium et de comparer les résultats pour les récepteurs de Ga-q couplé en l'absence ou en présence de Ga 16. Dosages alternatifs qui sont indépendantes de la protéine G interagissant pour détecter l'activation du récepteur peuvent également être effectuées, par exemple la translocation de l'arrestine GFP-étiqueté, ou la détection de changements dans le potentiel de membrane (par exemple,., Par le kit de dosage potentiel FLIPR membrane). Outre le Fluo-quatre heures utilisé ici, un large éventail d'autres fluorophores sensibles au calcium, chacune avec sa propre spectrale et chemicpropriétés al, est disponible. Le fluorophore plus approprié peut être choisi sur la base du type de cellule GPCR et le lecteur de plaque disponible, mais une vérification expérimentale est nécessaire. Les quantités d'ADN transfecté et l'ADN / transfection volume réactif nécessaire de déterminer pour chaque combinaison de ligne-réactif de transfection-récepteur cellulaire. Enfin, il convient de garder à l'esprit que les cellules en culture en continu permettent seulement de 20 à 25 passages utilisables pour effectuer les essais de criblage.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient la Fondation de recherche Flandre (FWO-Vlaanderen, Belgique, G.0601.11) et la KU Leuven Research Foundation GOA/11/002. IB, TJ et LT bénéficier d'une bourse de la FWO-Vlaanderen.
HEK293T cells | |||
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Trypsin-EDTA solution (0.25%) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | MP Biomedicals | 195173 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Penicillin-Streptomycin (P-S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
jetPRIME | Polyplus transfection | 114-01 | FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX & Plus Reagent (Life technologies) |
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0392 | |
Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
Reagent A100, Lysis buffer | Chemometec | 910-0003 | |
Reagent B, Stabilizing buffer | Chemometec | 910-0002 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
HBSS buffer: Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
NaOH (1 M) | Vel | 2781 | |
Pluronic acid | Invitrogen | P-3000MP | |
Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1,.. (Invitorgen) |
TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150) | Sigma-Aldrich | Z707503 and Z707554 | |
FlexStation device | Molecular Devices | NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices) | |
Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom | Greiner Bio-One | 655090 | Corning 96 well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | ||
Microcentrifuge tubes, siliconized | BioCision | BCS-2470 | |
Polystyrene V-shaped 96-well plates | Greiner Bio-One | 651101 | |
96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
Soft Max Pro software | Molecular Devices |