القائم على مضان الكالسيوم مقايسة تعبئة هنا وصف هو عكس الصيدلة نظام الفرز المتوسطة الإنتاجية للتعرف على تفعيل وظيفيا يجند (ق) من الأيتام G-البروتين يقترن مستقبلات (GPCRs).
لأكثر من 20 عاما، وقد تم الصيدلة عكس استراتيجية بارزة لاكتشاف بروابط تفعيل اليتيم G-البروتين يقترن مستقبلات (GPCRs). بداية من فحص الصيدلة العكس هو استنساخ وترنسفكأيشن اللاحقة من النوع من الاختزال من الفائدة في نظام التعبير الخلوية. ثم يتم الطعن في مغاير أعرب مستقبلات مع مكتبة مجمع بروابط مرشح لتحديد يجند تفعيل مستقبلات (ق). يمكن تقييم تفعيل مستقبلات عن طريق قياس التغيرات في تركيز جزيئات ثاني مراسل رسول، مثل الكالسيوم أو المخيم. الكالسيوم مقايسة تعبئة القائم على مضان الموصوفة هنا هو استخداما المتوسطة الإنتاجية عكس الصيدلة الفحص. وأعرب النوع من الاختزال يتيم عابر في الإنسان الجنينية 293T الكلى (HEK293T) خلايا ومنحل Gα 16 بناء يشارك transfected. التالية يجند ملزمة، وتفعيل الوحيدات Gα 16 الحث على الافراج عن و الكالسيومROM الشبكة الإندوبلازمية. قبل الفحص يجند، يتم تحميل خلايا، معربا عن مستقبلات مع مؤشر الكالسيوم الفلورسنت، فلوو-4 acetoxymethyl. إشارة الفلورسنت من فلوو-4 لا يكاد يذكر في الخلايا تحت ظروف الراحة، ولكن يمكن تضخيمها أكثر من 100 أضعاف على التفاعل مع أيونات الكالسيوم التي تم إصدارها بعد تنشيط مستقبلات. لا تتطلب هذه التقنية وصف إنشاء تستغرق وقتا طويلا من خطوط الخلايا ستابلي والتي تتكامل في المادة الوراثية transfected في جينوم الخلية المضيفة. بدلا من ذلك، ترنسفكأيشن عابرة، مؤقتة توليد التعبير عن الجينات المستهدفة، غير كافية لتنفيذ الفحص الفحص. الإعداد يسمح المتوسطة الإنتاجية فحص مئات من المركبات. شارك في ترنسفكأيشن من منحل Gα 16، والتي لمعظم الأزواج GPCRs، بما يسمح للإشارات بين الخلايا مسار إعادة توجيهك نحو إطلاق سراح الكالسيوم، بغض النظر عن مسار الإشارات المحلية في ضبط الذاتيةبالجلسات. الخلايا HEK293T من السهل التعامل معها وأثبتت فعاليتها على مر السنين في مستقبلات المقايسات deorphanization. ومع ذلك، والتحسين للمقايسة لمستقبلات معينة قد تبقى ضرورية.
G مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs) تشكل واحدة من أكبر والأكثر تنوعا بين جميع الأسر بروتينات سطح الخلية. وجودهم في الفقاريات واللافقاريات والنباتات، والخميرة، وسال لعابه العفن، وكذلك في البروتوزوا وأقرب مزدوج الطبقات المنتشة Metazoa يشير إلى أن GPCRs هي من بين أقدم الجزيئات مرتبطة مع نقل الإشارة 1. تشمل بروابط بهم تفعيل الطبيعية مجموعة متنوعة واسعة من المحفزات الخارجية بما في ذلك الببتيدات والأمينات الاحيائية، عطر، بروتينات سكرية، والفوتونات 2. على هذا النحو، وتشارك هذه الأنظمة إشارات مستقبلات يجند في مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات الفيزيولوجية. وظيفية واسعة الطيف يجعلها مناسبة بشكل مثالي لتطوير العقاقير العلاجية التي تغطي مجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان. وتمثل نحو 50-60٪ من المخدرات الأهداف الحالية GPCRs 3،4. إلى جانب أهميتها الكبرى في صناعة الأدوية، GPCRs أيضا في دائرة الضوء لتطويرجيل جديد من المبيدات الحشرية أنواع محددة 5،6 والمبيدات بشكل عام. لأن بروابط الطبيعية لكثير من GPCRs لا تزال مجهولة، وتصنف على أنها GPCRs اليتيم. سوف deorphanization هذه المستقبلات تحسين فهم الأدوار الفسيولوجية في الكائنات الحية، ويمكن الكشف عن الأهداف المفترضة للتطبيقات دواء جديد 7.
منذ عهد الجيني، يتم تطبيق على نطاق واسع الاستراتيجية الصيدلة العكسي لdeorphanization من GPCRs 8. يعني النهج أن مستقبلات اليتيم يستخدم ك "هوك" إلى "سمكة خارج" يجند تفعيل لها من استخراج البيولوجية أو من مكتبة من المركبات الاصطناعية. ولذلك استنساخ النوع من الاختزال المصالح وtransfected في وقت لاحق في نظام التعبير الخلوية. في الأساليب الأكثر شيوعا، يتم تحديد تنشيط مستقبلات عن طريق قياس التغيرات في تركيز جزيئات ثاني رسول 9 </suع>. الرئيسية المقايسات فحص مستقبلات تعتمد على البروتينات الحساسة للإضاءة الحيوية الكالسيوم (على سبيل المثال، aequorin) 10 أو مؤشرات الكالسيوم الفلورسنت (على سبيل المثال، فلوو-4) 11. المقايسات القائم على مضان، والتي يتم تحميل خلايا، معربا عن مستقبلات مع مؤشر الكالسيوم الفلورسنت قبل الفحص يجند، لديها ميزة أنها تسمح الفرز الفائق الإنتاجية بسبب سهولة استخدامها، والوقت قصير القراءة، ومرونة الفرز مستقبلات اليتيم متعددة على لوحة واحدة 12.
هنا، يوصف بدقة فحص الكالسيوم تعبئة القائم على مضان ويتضح من عملية deorphanization من ذبابة الفاكهة السوداء البطن قصيرة نيوروبيبتيدي F (SNPF) مستقبلات. وقد تميزت هذه neuropeptidergic نظام الإشارات في الأصل من قبل ميرتنز وآخرون. في عام 2002 13 مع تلألؤ بيولوجي مقايسة الكالسيوم أجريت في الهامستر الصينية المبيض (شو) الخلايا14 وفنغ وآخرون في عام 2003 مع مقايسة الكهربية باستخدام البويضات القيطم 15. يبدو وجود أنظمة الإنذار SNPF ان تقتصر على الأسرة في اللغات من المفصليات، حيث تورط في مجموعة واسعة من العمليات بما في ذلك تنظيم التغذية، والنمو، ردود فعل الإجهاد، وتحرك، وايقاعات كل يوم 16.
البحث على أنظمة إشارات neuropeptidergic في الحشرات قد لا يؤدي إلا إلى أهداف جديدة لتطوير المبيدات الحشرية، ولكن معرفة أدائها ويمكن أيضا استقراء نحو الكائنات الحية الأخرى تم العديد من أنظمة الإشارات عموما حفظا جيدا في جميع أنحاء تطور 17. في العقد الأخير، أحرز تقدم كبير في عملية deorphanization من GPCRs نيوروبيبتيدي الحشرات. على الرغم من هذه الجهود، تم يقابل عددا صغيرا فقط من المستقبلات ليجند بها وما شابه ذلك، والكثير من المعلومات عن تسلسلأصبح GPCRs اليتيم الجديدة المتاحة نتيجة لازدهار الجينوميات 18. توافر متوسطة / عالية الإنتاجية النهج الفرز، مثل الكالسيوم مقايسة تعبئة القائم على مضان أن ثبت أن تقنية تطبيقها على نطاق واسع 9،18، وبالتالي لا تقدر بثمن.
يتم تنفيذ فحص الكالسيوم تعبئة القائم على مضان كما هو موضح هنا في الإنسان الجنينية و293T الكلى (HEK293T) خط الخلية ويستخدم المسبار الفلورسنت لتحديد التغييرات في تركيزات الكالسيوم داخل الخلايا على تنشيط مستقبلات. لضمان التعبير عالية ومستويات ترجمة للمستقبلات، يتم إضافة تسلسل إجماع كوزاك 19 إلى 5 'نهاية تسلسل الترميز مستقبلات، والتي يتم استنساخ لاحقا في ناقلات التعبير (على سبيل المثال، pcDNA سلسلة ناقلات لخطوط خلايا الثدييات). كما أنه من الصعب التنبؤ الذاتية G البروتين من اقتران النوع من الاختزال اليتيم على أساس تسلسل المعلوماتوحدها، وجزيئات رسول الثانية (على سبيل المثال، الكالسيوم أو المخيم) التي يتم التضمين بعد تنشيط مستقبلات في كثير من الأحيان لا تزال مجهولة قبل تحديد يجند. للتحايل على هذه المشكلة، والبروتينات G منحل من عائلة G ف (على سبيل المثال، الفئران Gα 15 أو الإنسان Gα 16 [المستخدمة هنا]) أو البروتينات G خيالية (على سبيل المثال، Gα qi5) التي تتفاعل مع معظم GPCRs وتحفز اطلاق سراح الكالسيوم يمكن يشترك-أعرب 20،21،22. على الملزم ليجند لمستقبله، وتخضع لعملية تغيير النوع من الاختزال بتكوين الذي يؤدي إلى تفعيل مسارات محددة داخل الخلايا. وغوانوزين ثنائي فسفات (GDP) جزيء، ملزمة في ظل ظروف يستريح إلى الوحيدات Gα 16، وسوف تحل محلها ثلاثي الفوسفات غوانوزين (GTP) جزيء. هذا يثير التفكك من البروتين G heterotrimeric في Gα 16 و Gβγ الوحيدات. الوحيدات Gα 16 ينشط فسفوليباز C &# 946؛ (PLCβ)، والذي بدوره hydrolyzes في غشاء محدد فوسفتيدلينوستول bisphosphate (PIP 2) مما أدى إلى مادة ال diacylglycerol (DAG) وtrisphosphate اينوزيتول (IP 3). سوف IP 3 منتشرة في جميع أنحاء السيتوبلازم وينشط IP قنوات الكالسيوم التي تعتمد على 3 الموجودة في غشاء الشبكة الإندوبلازمية، الذي يحث على الإفراج عن الكالسيوم في السيتوبلازم.
الافراج الكالسيوم على تنشيط مستقبلات يحدث في غضون ثوان، ويمكن أن يتم الكشف عن طريق تحميل الخلايا قبل الفحص الفحص مع صبغة الكالسيوم الحساسة، مثل فلوو-4 acetoxymethyl (ص) 11. وAM استر المجموعة تمكن fluorophore لعبور غشاء الخلية والمشقوق قبالة عن طريق الاسترات حشوية مرة واحدة داخل الخلية. وبالتالي، يتم الكشف عنهم التهم السلبية للصبغة الفلورسنت، ومنعه من نشرها خارج الخلية والسماح لها أن تتفاعل مع أيونات الكالسيوم. إشارة فلوري سو فلوو-4 لا يكاد يذكر في الخلايا تحت ظروف الراحة التي تحتوي على تركيزات الكالسيوم فقط في نطاق nanomolar. ومع ذلك، عندما يتم تحريرها على تنشيط مستقبلات الكالسيوم، ويمكن الإشارة زيادة تركيز تابع لأكثر من 100 أضعاف، وضمان بموجبه نسبة كبيرة إشارة إلى الضوضاء. FLUO-4 المعروضات أيضا مجموعة ديناميكية كبيرة للإبلاغ [الكالسيوم] حول K د (الكالسيوم) من 345 نانومتر، مما يجعلها مناسبة لقياس التغيرات الفسيولوجية ذات الصلة الكالسيوم في مجموعة واسعة من الخلايا. إثارة فلوو-4 يحدث في 488 نانومتر، ويتم قياس الانبعاثات مضان في 525 نانومتر 11. Fluorimeters مثل قارئ لوحة التصوير مضان (FLIPR) 23، وNOVOstar، أو FlexStation (جهاز المحطة) هي 12 / نظم عالية الإنتاجية المتوسطة التي تسمح في وقت واحد بالإضافة إلى ذلك المجمع وكشف عن إشارة فلوو-4 على تنشيط مستقبلات لكل جيدا في لوحة الفحص. مقايسة تعبئة الكالسيوم وصفها هنا تعتمد على المحطة96 جهاز جيدا نظام صفيحة ميكروسكوبية.
يتم استخدام SoftMax برو البرمجيات (البرمجيات) لتشغيل جهاز المحطة وكذلك لتحليل البيانات. البرنامج يعرض على الفور النتائج على النحو الرسوم البيانية في شكل 96 جيدا. يمكن اختيار آبار متعددة في وقت واحد لمقارنة نتائج هذه الآبار على نفس الرسم البياني. يتم قياس وحدة الفلورسنت النسبي (RFU) القيم الآبار في كل عمود في وقت واحد لمدة دقيقتين، تبدأ قبل إضافة مركبات للآبار واستمرار بعد قياس إشارة الفلورسنت التالية تنشيط مستقبلات. عادة، اتجاه منحنى ناهض ينسجم مع خط الأساس حتى يتم إضافة مركب تفعيل إلى الخلايا، مما أدى إلى زيادة سريعة للإشارة الفلورسنت. ويرتبط ارتفاع الذروة مع تركيز ناهض النهائي في البئر. بعد الذروة، إشارة الفلورسنت يسقط ببطء نحو مستوى خط الأساس. القياسات RFU كاليفورنيان تحويلها إلى منحنيات التركيز والاستجابة لتحديد القيمة EC 50 (التركيز الفعال نصف القصوى) ليجند. بشكل عام، لا يقل عن ثلاث شاشات مستقلة، كل منها ثلاث نسخ طبق الأصل من سلسلة التركيز، ويجب أن يتم تنفيذ لإنشاء منحنى التركيز على الاستجابة موثوق بها.
فمن المستحسن لتشمل العديد من الضوابط الإيجابية والسلبية في التصميم التجريبي. أولا، عنصر تحكم ترنسفكأيشن، أي تنفيذ مستقبلات مع يجند المعروف، وينبغي اختبار. وهذا يسمح التحقق ما إذا كان وكيل ترنسفكأيشن التشغيلية. ينصح إدماج تجربة التحكم مع ناهض لمستقبلات الذاتية من خط الخلية والسيطرة السلبية (على سبيل المثال، غسل العازلة) أيضا لمراقبة صحة وسلامة الخلايا واستبعاد احتمال أن غسل العازلة كانت ملوثة أحد العوامل التي يمكن أن تثير لصناعة السيارات في fluoreاستجابة رائحة. منبهات استخداما هي الببتيد المستمدة من تنشيط مستقبلات الأنزيم البروتيني-1 (PAR 1)، الذي يعمل بمثابة PAR 1 ناهض انتقائية، أو كرباكول، والذي ينشط مستقبلات أستيل. وينبغي أيضا أن يتم اختبار الخلايا transfected مع متجه التعبير فارغة إلى استبعاد أن المركبات النشطة تتفاعل مع مستقبلات الخلية الذاتية. تعظيم الاستفادة من العديد من المعلمات موضح في البروتوكول أدناه قد تكون هناك حاجة لأنظمة إشارات مختلفة. ويصور شخصية التخطيطي القائم على مضان كاملة الكالسيوم مقايسة تعبئة في الشكل 1.
يتم إجراء قياسات الشكل 1. مخطط الشامل لفحص الكالسيوم تعبئة القائم على مضان. الآلي التعامل مع السائل ومضان في وقت واحد مع محطةقارئ صفيحة ميكروسكوبية الجهاز، مدفوعا البرمجيات. يحتوي الجهاز محطة ثلاثة أدراج: واحد للخلية لوحة، لوحة المركبة وطرف الرف. التحويلات pipettor في بناء المركبات من عمود واحد من لوحة مركب إلى العمود المقابلة من لوحة الخلية (الخطوة 1). كل بئر من لوحة الخلية تحتوي على أحادي الطبقة من الخلايا HEK293T التي تم التعاون مع transfected-النوع من الاختزال من الفائدة ومنحل Gα 16 الوحيدات. عندما ينشط مستقبلات مركب، يتم استبدال الناتج المحلي الإجمالي Gα 16 ملزمة من قبل GTP. الوحيدات Gα 16 تنأى في وقت لاحق من مجمع Gβγ وينشط فسفوليباز Cβ (PLCβ)، والذي بدوره hydrolyzes فوسفتيدلينوستول bisphosphate (PIP 2) مما أدى إلى مادة ال diacylglycerol (DAG) وtrisphosphate اينوزيتول (IP 3). IP 3 ينشط IP التي تعتمد على قنوات 3 الكالسيوم الموجودة في غشاء الشبكة الإندوبلازمية، الأمر الذي أدى إلى الإفراج عن كثافة الكالسيومس السيتوبلازم. تفاعل الكالسيوم مع فلوو-4 (التي يتم تحميلها على الخلايا قبل تفاقم إضافة) النتائج في إشارة الفلورسنت (الخطوة 2). البرنامج يعرض النتائج على النحو حدة الفلورسنت النسبي (RFU) القيم في وظيفة من الزمن، ومرتفعات الذروة ترتبط مع تركيز يجند بطريقة تعتمد على التركيز. ويمكن بعد ذلك تحويل هذه البيانات إلى منحنى التركيز والاستجابة لتحديد القيمة EC 50 من زوج يجند مستقبلات (الخطوة 3).
تم تطبيق فحص الكالسيوم تعبئة القائم على مضان بنجاح لتأكيد توصيف وظيفي للنظام ببتيدي المفعول إشارات ذبابة الفاكهة SNPF، التي كان يؤديها بالفعل ميرتنز وآخرون. مع فحص تلألؤ بيولوجي وفنغ وآخرون. مع مقايسة 13،15 الكهربية. قيم EC 50 تم الحصول عليها مع مقايسة مضان في الخلايا HEK293T حوالي 10 أضعاف أقل من تلك التي حصلنا عليها مع مقايسة تلألؤ بيولوجي يؤديها في الخلايا CHO (دروم-SNPF-1: FLUO = 2.04 نانومتر، ومي = 51 نانومتر؛ دروم-SNPF- 2: FLUO = 5.89 نانومتر، ومي = 42 نانومتر؛ دروم-SNPF-3: FLUO = 5.55 نانومتر، ومي = 31 نانومتر؛ دروم-SNPF-4: FLUO = 0.50 نانومتر، ومي = 75 نانومتر). هذه الاختلافات يمكن تفسيرها من خلال عدة عوامل، بما في ذلك حقيقة أن واحدا من أنظمة التعبير المستخدم قد يكون أكثر ملاءمة للتعبير الوظيفية للمستقبلات معينة، أو قابلة للطي من بعض المستقبلات يمكن أن تكون أقل كفاءة في جأنواع الخلايا ertain. قيم EC 50 من كل أربعة الببتيدات دروم-SNPF هي في حدود nanomolar عند اختباره على مستقبلات مع كل من مضان وفحص تلألؤ بيولوجي، ودعم عموما أهمية الفسيولوجية التي تفاعل مستقبلات الببتيد في الجسم الحي.
لاحظ عدم وجود رقابة ترنسفكأيشن مع مستقبلات لوالذي يعرف يجند تفعيل أدرج في الشاشة المعروضة هنا، وذلك لأن نظام الإشارات ذبابة الفاكهة SNPF عادة السيطرة ترنسفكأيشن في الاجهزة التجريبية. أدرجت سيطرة إيجابية مع يجند الذاتية للخلايا HEK293T (PAR 1) والسيطرة السلبية (غسل العازلة) في الشاشة. أظهرت نتائج PAR 1 أن الخلايا كانت في حالة جيدة. فإن السيطرة السلبية (غسل العازلة) لا تثير إشارة الفلورسنت، مما يدل على أن الوسط الذي تذوب الببتيدات كانت خالية من أي من الملوثات التي يمكن أن الوقود النووي المشعluence النتائج.
تم استخدام نظام الإشارات ذبابة الفاكهة SNPF تتميز سابقا هنا لشرح فحص الكالسيوم تعبئة القائم على مضان. لهذا الغرض، تم اختبار سلسلة تركيز بروابط تفعيل على الفور. ومع ذلك، عندما يتم إحضارها على مستقبلات اليتيم إلى من overexpression في فحص فحص لاختبار مكتبة تحتوي على مئات من المركبات، فمن المستحسن أن الشاشة الأولى مع تركيزات عالية نسبيا النهائي للبروابط (على سبيل المثال، 10 أو 1 ميكرومتر). بعد الكشف عن مركب تفعيل، سلسلة التخفيف من هذا المركب يمكن فرزهم من أجل أن يؤلف منحنى التركيز والاستجابة وتحديد قيمة EC 50.
مرة واحدة يتم تحديد يجند تفعيل لمستقبلات، يمكن التحقيق إشارات مسار الخلايا مزيدا من التكيف مع البروتوكول. لا يمكن أن يؤديها الفحص كما هو موضح أعلاه، ولكن من دون التعاون transfecting مجموعة ^5 و 16 الوحيدات. عندما يتم قياس استجابة الكالسيوم، فهذا يعني أن الأزواج مع مستقبلات الذاتية Gα ف الوحيدات من نظام التعبير الخلوية. عندما لوحظ عدم وجود إشارة الفلورسنت، ويمكن تطبيق بروتوكولات لقياس التغيرات في تركيزات رسل ثانوية أخرى (على سبيل المثال، المخيم).
ويمكن أيضا أن تتم العلاقة بين الهيكل والنشاط (SAR) دراسات لتحديد تسلسل الأساسية الببتيد هو مطلوب لتنشيط مستقبلات. أولا، يتم تقييمها لتحديد تسلسل اقتطاع الحد الأدنى من تسلسل الأحماض الأمينية من الببتيد التي لا تزال قادرة على تنشيط مستقبلات. المقبل، ويمكن اختبار الببتيدات التي منهجي تم استبداله كل الأحماض الأمينية للحصول على بقايا ألانين. اختبار الاصطناعية سلسلة ألانين بدائل على مستقبلات يسمح لتحديد أهمية كل من الأحماض الأمينية لتنشيط مستقبلات 24،25.
على الرغم من استخدامه المتكرر وايفي ثبتcacy، فإنه لابد من التأكيد على أن مقايسة الموصوفة هنا قد تحتاج الى بعض التعديلات للحصول على نتائج أفضل لمستقبلات محددة من الفائدة. الوحيدات Gα 16 لديه ميزة أنه يربط معظم GPCRs، ولكن قد يكون لها أيضا تأثير سلبي على المهيمنة على المستقبلات التي التطور الطبيعي الزوجين عبر Gα ف 22. في هذه الحالة، قد يكون من المفيد لاختبار مجموعات مختلفة من البروتينات G خلال تعظيم الاستفادة من مقايسة الكالسيوم الرواية ومقارنة النتائج للGα مستقبلات مقترنة ف في غياب أو وجود Gα 16. ويمكن أيضا فحوصات البديلة التي تكون مستقلة من البروتين G التفاعل للكشف عن تنشيط مستقبلات أن يؤديها، مثل إزفاء من GFP المسمى arrestin، أو الكشف عن التغيرات في غشاء المحتملة (على سبيل المثال، من قبل FLIPR غشاء الفحص كيت المحتملة). إلى جانب فلوو-04:00 المستخدمة هنا، مجموعة واسعة من fluorophores الكالسيوم الحساسة الأخرى، مع كل الأطياف الخاصة وكيميائيخصائص القاعدة ومتاح. يمكن تحديد fluorophore الأنسب على أساس النوع من الاختزال، نوع من الخلايا وقارئ لوحة المتاحة، ولكن التحقق التجريبي هو ضروري. كميات من الحمض النووي transfected والحمض النووي / ترنسفكأيشن حاجة كاشف نسبة يتم تحديدها لكل مستقبلات ترنسفكأيشن تركيبة خط خلية كاشف. أخيرا، ينبغي أن يوضع في الاعتبار أن الخلايا في الثقافة مستمرة تسمح فقط 20-25 المقاطع التي يمكن استخدامها لإجراء فحوصات الفرز.
The authors have nothing to disclose.
والكتاب يعترف فلاندرز بحوث مؤسسة (FWO-VLAANDEREN، بلجيكا، G.0601.11) وجامعة لوفين الكاثوليكية البحوث في مؤسسة GOA/11/002. IB، TJ وLT الاستفادة من زمالة من FWO-VLAANDEREN.
HEK293T cells | |||
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Trypsin-EDTA solution (0.25%) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | MP Biomedicals | 195173 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Penicillin-Streptomycin (P-S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
jetPRIME | Polyplus transfection | 114-01 | FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX & Plus Reagent (Life technologies) |
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0392 | |
Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
Reagent A100, Lysis buffer | Chemometec | 910-0003 | |
Reagent B, Stabilizing buffer | Chemometec | 910-0002 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
HBSS buffer: Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
NaOH (1 M) | Vel | 2781 | |
Pluronic acid | Invitrogen | P-3000MP | |
Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1,.. (Invitorgen) |
TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150) | Sigma-Aldrich | Z707503 and Z707554 | |
FlexStation device | Molecular Devices | NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices) | |
Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom | Greiner Bio-One | 655090 | Corning 96 well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | ||
Microcentrifuge tubes, siliconized | BioCision | BCS-2470 | |
Polystyrene V-shaped 96-well plates | Greiner Bio-One | 651101 | |
96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
Soft Max Pro software | Molecular Devices |