我们描述了全球性RNA合成缺氧使用成像分析技术。以前没有缺氧条件下进行的RNA点击化学标记,并允许全球的RNA变化的可视化在单细胞水平。这种方法将与现有的平均值RNA技术,允许的细胞 – 细胞间的变化在全球RNA合成的直接可视化。
的氧气供应缺氧或降低参与了许多生理和病理过程。在分子水平,细胞启动一个特定的转录程序,以安装适当的和协调一致的细胞反应。该电池具有需要分子氧作为辅助因子的活性几个氧传感器的酶。这些范围从脯氨酰羟化酶组蛋白去甲基化酶。大多数研究分析细胞对缺氧是基于蜂窝人口和平均的研究,并作为缺氧细胞的这种单细胞分析很少执行。这里我们描述了在低氧单细胞水平通过使用按此-IT RNA的成像盒中的控制氧工作站,随后显微镜分析和定量全球RNA合成的分析方法。采用低氧不同的时间长度的癌细胞,RNA标记和测量的每个小区中。这种分析可以的时间和细胞 – 细胞在全球RNA合成下列低氧应激的变化的可视化。
当正常的氧气供应,组织受到干扰缺氧(低氧张力)发生。环境氧既是养分和信号传导分子,提供了重要的线索对许多类型的细胞。被改变的环境氧气通过一组控制的重要转录因子家族被称为缺氧诱导因子(HIFs)的双加氧酶的活性的检测。该HIFs是由两个亚基组成,α和β。有三种已知的(3 1,2,和)同种型,HIF-α和HIF-1β的多个剪接变体。 HIF-1β组成型表达,而不是由环境的氧气水平1调节。缺氧诱导因子-α家族成员是由一类脯氨酰羟化酶(博士)动态地调节和抑制因子缺氧诱导因子(FIH);两者都需要氧作为辅因子催化HIF-α2,3的羟化。常氧中的HIF-α家族成员羟基化和标记为proteosom人降解的E3连接酶,希佩尔林道(VHL)。在缺氧的博士和富士康是无效的或具有活性降低。的HIF-α亚型变得稳定时,形成与HIF-1β的异源二聚体,以及影响基因,提供对低氧环境( 图1A)的细胞应答的转录4。
当前技术用于RNA分析集中于平均值的跨越给定的细胞群体的定量。细胞对缺氧的刺激所引发的基因,使他们能够适应他们的恶劣环境5无数的转录反应。然而,缺氧往往存在一个梯度,以及细胞在缺氧的环境不受统一的缺氧刺激。我们描述了按此-IT RNA成像试剂盒的实施方案中的控制氧工作站检查全局RNA合成在缺氧单细胞水平。
RNA的成像试剂盒采用一lkyne-修饰核苷,5 -乙炔基尿嘧啶核苷(EU)和化学选择性连接,能够检测全局的RNA合成的时间和空间中的细胞和组织6。简言之,将细胞用缺氧和在欧盟的存在下进行培养。然后,他们的固定和通透和欧盟纳入新生RNA是由欧盟的化学选择性结扎用含叠氮染料的检测。一个典型的工作流用于此反应示于图1B中 。我们所使用的RNA的试剂盒的成像检查RNA的合成在起因于缺氧处理单细胞水平。
炔标签的小尺寸使得修饰的核苷的有效掺入到RNA的特异性。的化学选择性结扎或'点击'的反应是高效,快速和具体7-10。所有的反应成分是生物惰性,反应不需要极端的温度或溶剂。点击反应否定要求对传统的放射性标记,并允许结果的直接可视化,因为输出是光。另外,检测分子可以很容易地穿透复杂样品,允许多重分析包括抗体用于RNA-相互作用蛋白的检测。这种RNA成像法是用有机染料包括的Alexa Fluor和荧光素(FITC)兼容。
我们测量的RNA合成的变化下使用开放式显微镜环境下对远程对象(OMERO)的实施治疗我们的细胞。 OMERO是开源软件,可以在http://openmicroscopy.org/ 。这种显微镜图像可视化和分析软件可以访问和使用范围广泛的生物学数据,包括多维,异构数据集的管理。客户端应用程序允许远程可视化和复杂的生物图像数据11的分析;我们用它来量化在全球和单细胞RNA合成的视觉变化。使用该显微镜图像可视化和分析软件这些数据,并分析了RNA的成像实验所需的步骤如下所示。
我们看着下面的人骨肉瘤的治疗(U2OS)细胞缺氧长达24小时的全球RNA合成的变化。在所有情况下,我们检测到细胞 – 细胞间的变化的RNA生产水平。低氧暴露短的时间内未产生显著改变在细胞新生RNA的水平。然而,暴露于缺氧24小时导致RNA的细胞产生的量显著增加。大多数细胞对低氧的是以下的曝光时间较长,例如4〜24小时来测定。然而,一些机制落实到位早得多,例如; NF-κB的激活发生在低氧暴露12的5-15分钟。调查较短的低因此霞曝光时间是必要的,并可能有损于更复杂的反应,如细胞周期和凋亡。
我们已经描述了我们使用的RNA成像套件的研究缺氧对RNA合成的骨肉瘤(U2OS)细胞的作用。这一技术相对比较简单,并提供了有关在单细胞水平全局转录数据。我们修改了传统的协议,这个套件包含标签在缺氧室。据我们所知,这是使用这种技术来测量缺氧改变RNA合成的第一份报告。我们所使用的RNA的成像试剂盒适用于实验中缺氧,因为它不需要放射性同位素,并与在受控气氛工作站协同工作的限制技术上不兼容。常见的问题该技术关注有效固定和样品的标记。这是极为重要的是,煤灰用于固定样品是新鲜的和描述的一样,以确保样品的低背景染色执行遵循'点击'反应,该洗涤步骤。若bACKGROUND荧光变得建议的步骤2.7.4后洗一次,用1ml的RNA成像试剂盒反应漂洗缓冲的一个问题。
这里提到的RNA成像套件代表了RNA成像技术一个显著进步在易用性和特异性的反应和速度方面。这种技术是通过它需要以标记样品中的时间主要限制。 RNA的成像套件需要,防止在全球RNA的快速变化通常会发生此期限内的考试有1小时的贴标时间。正是由于这个原因,我们的第一时间点被限制为1小时和15分钟。该技术被用在很大程度上涉及与试剂的相容性和其它荧光标记物,例如,该RNA成像试剂盒不与鬼笔环肽染色兼容其他一些局限性有关。
研究RNA合成细胞的所有现有的方法都是基于修饰核苷的掺入新生RNA和结合标签通过不同方式的检测。开拓方法是基于用放射性标记的RNA前体随后检测与放射自显影。这种方法导致了发现细胞周期阶段和其他重要发现;然而,它有很多缺点,例如放射性工作中,长曝光时间和放射自显影6的低分辨率图像的笨重的性质。在该领域的未来提前利用免疫组织化学的方法,以消除放射性的必要性。 RNA的标记由BRU注册成立后免疫组化检测。然而,有效的抗体结合所需核酸变性,改善获得的DNA或导致的细胞形态丢失和损坏的许多蛋白质的抗原决定簇,以阻止其进一步的检测与荧光标记的抗体13的RNA。的“点击化学”技术的引入简化了检测步骤和t他的程序相比,放射自显影和免疫组化。该技术是基于叠氮 – 炔胡伊斯根环加成反应,其中的5-ethyniluridine末端炔烃与叠氮化物与结合在铜(I)的存在荧光团结合。该反应是特异性,快速,不需要任何额外的步骤,并且与免疫化学检测其它细胞成分容易相容。
使用该RNA的成像技术,我们发现,细胞,在相同的单层人群中,有不同的RNA合成水平响应于缺氧。我们限制了我们的实验中只检查RNA生产的影响;但是,它是完全可以用这样的RNA成像试剂盒进行修改,附加的多重反应中,允许对RNA的产量的更复杂的分析。例如,使用特异于活跃转录的标记物,如磷酸化的RNA聚合酶II或transla的偶数分量电平的次级抗体染色化机械给这个新产生的RNA被转化成蛋白质的量的指示是可能的。额外的蛋白质,如肌动蛋白,这不应该与低氧显著改变的蛋白质,可以测试作为一个额外的控制。此外,不同类型的细胞可以被测试,因为这很可能是不同的单元将具有不同的RNA合成速率和甚至不同的反应缺氧。
使用该RNA成像试剂盒是相当简单的提供作为所述被执行的步骤。在协议中的关键步骤涉及细胞接种,细胞固定和染色和图像采集。该板块的细胞所描述的密度,防止过或正在汇合在实验这将显著影响的结果是很重要的。同样重要的是用新鲜固定液,保证了电池的取最好的“快照”,并染色以减少BAC后洗涤细胞时要小心kground到一定水平,是可以接受的效率分析。最后,图像采集的方法是实现这一目标是一个质量足够好,以供后续分析的图像非常重要。我们建议您使用的最佳光镜可检查样品光学如本协议,可在最密集的研究中心在全球范围使用的显微镜。
The authors have nothing to disclose.
JB是CRUK临床研究员,AS是一个威康信托基金会博士研究生,在SR实验室是由CRUK高级研究奖学金(C99667/A12918)资助。这项工作是由两个威康信托基金会战略奖(097945/B/11/Z和095931/Z/11/Z)的支持。
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