神经元的密集核心囊泡的超分辨率成像
Summary
我们描述了如何实现光敏定位显微镜（PALM）为基础的固定，培养的神经元囊泡的研究。我们的协议的关键组件包括标签囊泡photoconvertible嵌合体，采集稀疏采样的原始图像的超分辨率显微镜系统，以及处理原始图像来产生超分辨率图像。
Abstract
荧光的检测提供了在现代生物学和医学应用中采用的许多广泛应用和迅速发展的显微镜技术的基础。荧光的优势包括其敏感性，特异性，并与实时成像的兼容性。不幸的是，荧光显微镜常规形式遭受一个主要弱点，衍射极限分辨率的成像平面，妨碍结构，尺寸比〜250纳米更小的研究。近日，这一限制已被克服，推出超分辨率荧光显微镜技术，如光敏定位显微镜（PALM）。不同于其传统的对应，PALM可以用几十纳米的横向分辨率的影像。因此，这是目前可以使用的荧光，以其无数的优势，阐明细胞结构和组织以前无法进入属性的频谱。
_content“>不幸的是，PALM是不平凡的实施和成功的战略往往必须针对系统所研究的类型。在这篇文章中，我们将展示如何实现固定，培养的神经元囊泡结构的单色PALM研究。 PALM是非常适合的囊泡，它的外形尺寸使通常为50〜250纳米。在我们的方法的关键步骤包括对研究神经元标记与photoconvertible（绿色到红色）的囊泡货物嵌合体，采集稀疏采样的原始图像与超高分辨率显微镜系统，以及处理原始图像以产生一个高分辨率的手掌图像。我们还证明我们的方法的功效通过在培养的海马神经元呈现致密核心囊泡的格外好分辨图像（DCV值），该反驳这一假设的DCV值的突触外贩卖很大程度上是由DCV簇介导的。Introduction
许多细胞过程，依赖于生物分子的准确，高效的囊泡介导拐卖到特定的亚细胞的目的地。一个突出的例子是突触组装，这是之前长程，囊泡介导突触传递的成分从生物合成中的神经元胞体部位潜在的远端前和突触后位点1。
荧光显微镜是一个强大的和流行的研究囊泡运输的方法。该技术的优势包括其敏感性，特异性，并与实时成像2的兼容性。不幸的是，直到最近，这项技术已经遭受一个主要弱点，衍射极限分辨率2，妨碍结构，尺寸比〜250纳米更小的研究。近日，在荧光显微镜的横向分辨率超过了衍射障碍，推出的超分辨率荧光显微显微术技术，诸如PALM 3。 PALM的横向分辨率，几十纳米，非常适合小泡，其中有尺寸，通常介于50〜250 nm的4的研究。因此，这是目前可以使用的荧光，以其无数的优势，阐明囊泡以前无法进入的属性，包括其贩运到特定的亚细胞位点的某些方面的频谱。
PALM是不容易实现，并成功的战略往往必须针对系统所研究的类型。在这里，我们描述了如何实现囊状结构的PALM研究，我们证明我们的DCV值的海马神经元的情况下方法的有效性。特别是，我们使用Palm解决假说DCV值的贩运到海马神经元突触是由DCV集群5-8介导的。
囊泡簇介导的贩运在发展Ñ突触eurons是一个有趣的可能性，因为它可以促进突触快速稳定和装配9,10。 DCV值的聚集贩卖的支持者举出突触外荧光泪点外源性窝藏的DCV货物作为证据支持集群6大明显的大小。然而，这些泪点出现在使用衍射限制的荧光显微镜技术，它不适合于从由聚类所产生的因衍射鉴别晶粒尺寸效应所产生的图像。
要解决此问题，我们收集了常规的宽视场荧光和海马神经元表达有针对性地DCV值嵌合体PALM图像。这些图像的分析表明，推定的突触外DCV簇在常规图像中> 92％的被解析为80纳米（个人DCV尺寸）11泪点在PALM图像。因此，这些数据的聚类假设基本上无效应用于DCV值在显影hippocaMPAL神经元。
Protocol
Representative Results
Discussion
Palm和相关超分辨率荧光显微技术，最近成为一个有价值的补充，以更好地建立表格光学显微镜和电子显微镜（EM）22-24。 PALM的积极属性包括相对简单的样品制备和最小的样品扰动。原则上，PALM也可以用于研究活细胞。大概PALM的主要负属性是费时的数据采集，从而阻碍了显著更快的动力学过程研究在活细胞中。此外，Palm是相对较新，因此适当的，稳健的荧光基团和样品制备和数据采集和…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是支持由美国国立卫生研究院授予2 R15 GM061539-02（以BAS），2 R15 NS40425-03（对JEL），MH 66179（俄勒冈健康与科学大学/ OHSU的银行家加里博士），和P30 NS061800（以OHSU的苏艾舍博士）。我们感谢芭芭拉Smoody与海马神经元的文化的广泛支持，和Drs。布赖恩长和詹姆斯阿布尼这个手稿的批判性阅读。
Materials
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technoligies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| growth glass coverslips 18mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
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