Baseado na polarização Reflexo Interna Total de microscopia de fluorescência (pTIRFM) permite a detecção em tempo real, a dinâmica da membrana da célula. Este artigo descreve a implementação de pTIRFM para o estudo da remodelação da membrana durante a exocitose regulada. A técnica é generalizável a outros processos em biologia celular que direta ou indiretamente envolvem mudanças na forma de membrana.
Para ganhar novos insights sobre a dinâmica de exocitose, o nosso grupo se concentra sobre as mudanças na forma de bicamada lipídica que devem ser precisamente regulados durante a fusão das membranas das vesículas e plasma. Essas mudanças rápidas e localizadas são alcançados por meio de interações dinâmicas entre lipídios e proteínas especializadas que controlam a curvatura da membrana. A ausência de tais interações não só teria conseqüências devastadoras para a fusão da vesícula, mas uma série de outras funções celulares que envolvem o controle da forma de membrana. Nos últimos anos, a identidade de um certo número de proteínas com propriedades de formação de membrana foi determinada. O que continua faltando é um roteiro de quando, onde e como eles agem como fusão e progresso de liberação de conteúdo.
A nossa compreensão dos eventos moleculares que permitem a remodelação da membrana tem sido historicamente limitada pela falta de métodos analíticos que são sensíveis à curvatura da membrana ou com a resolução temporal de track mudanças rápidas. PTIRFM satisfaz ambos os critérios. Discutimos como pTIRFM é implementado para visualizar e interpretar mudanças rápidas e submicrométricas na orientação das membranas das células cromafins durante denso núcleo vesícula (DCV) fusão. As células cromafins que usamos são isolados a partir de glândulas supra-renais de bovinos. A membrana é marcadas com um corante de carbocianina lipofílico, 1,1 '-dioctadecilo-3, 3,3', 3'-tetramethylindodicarbocyanine, 4-clorobenzenosulfonato, ou fez. DiD intercala no plano da membrana com uma orientação "fixo" e, portanto, é sensível à polarização do campo evanescente. A membrana celular fez-marcadas, seja sequencialmente animado com polarizações ortogonais de um laser de 561 nm (p-pol, s-pol). Um laser de 488 nm, é usado para visualizar os componentes de vesícula e tempo do momento de fusão. A exocitose é desencadeada por localmente perfusing células com uma solução de KCl despolarizante. A análise é realizada off-line utilizando software escrito sob medida para entender como é quemudanças de intensidade de emissões relacionadas com a fusão dos poros dilatação.
A execução adequada de exocitose requer mudanças radicais na forma de bicamada de membrana para ser precisamente orquestrada. Antes da fusão, dobra local da membrana do plasma sob o grânulo ocorre, em parte para reduzir a barreira de energia para a interacção de bicamadas. Mais tarde, como membranas de fusão, as áreas de elevado grau de curvatura são geradas e devem ser estabilizados. Finalmente, as membranas fundidas devem ser dobradas para fora de sua forma inicial para expandir o poro de fusão e permitir liberação de conteúdo 1. Porque as membranas por si só não são susceptíveis de sofrer tais mudanças dramáticas e coordenadas, as proteínas são necessárias para mediar eventos. Mas como eles agem para influenciar mudanças na topologia da membrana durante o processo de fusão continua muito uma questão em aberto.
Excelente em modelos in vitro, existe a visualizar a curvatura da membrana. O uso do EM negativo mancha, por exemplo, tem sido importante para moldar modelos moleculares atuais para as ações de dois grandes tráfico proteins – sinaptotagmina e dynamin (para revisões, ver Chapman 2 e Henshaw 3). A maioria dos ensaios em tempo real de exocitose não detectam curvatura diretamente. Em vez disso, a curvatura é inferida a partir de ensaios que informam sobre a cinética da libertação da carga de lúmen 4-8 ou mudanças na área de membrana 9-11. PTIRFM preenche a lacuna entre in vivo e in vitro, permitindo, medições diretas em tempo real das mudanças na micromorfologia membrana.
PTIRFM, em um modo nonimaging, foi iniciada por Axelrod e colegas para medir a orientação do NPD-PE incorporados dentro de um modelo de membrana 12. A técnica foi então aplicado a visualizar as alterações dinâmicas em células vivas marcadas com DII e FM1-43 13-18. Em pTIRFM, duas polarizações campo evanescente são utilizados para excitar sequencialmente uma sonda incorporado à membrana: p-polarização (no plano de incidência) e s-polarização (perpendicular ao plano de incidência). Antes da imagiologia, a sonda – neste caso, fez – se rapidamente adicionados ao meio extracelular, e é permitido intercala nas membranas plasmáticas das células a serem estudadas. Nas regiões onde a membrana não é paralelo à lamela (como em um plissado membrana ou recuo), o fez também será não paralela. Portanto, tais regiões estarão excitável pelo feixe de p-pol. O feixe de p-pol será menos eficaz excitar fez em regiões da membrana que são na sua maioria paralelas à lamela. Imagens rácio pixel a pixel (P / S) relatórios sobre a emissão de seqüencial de excitação e p-s-pol de fez, portanto, destacar especificamente as regiões de deformação da membrana. Em teoria, as imagens relação P / S são sensíveis a pequenos ângulos de desvio da membrana plasmática da lamela, com a amplitude das mudanças previstas por simulações de computador 18. Imagens P / S são também independentes da distância a partir da superfície do fluoróforo e lamela fluoróforo locaisconcentração. Concentração de fluoróforo local em vez disso é fornecido por meio de imagens de relatórios sobre a soma de pixel-a-pixel da emissão P e duas vezes a emissão S (P 2 S). A medição P 2 S é sensível à geometria precisa da reentrância, com algumas, pouca, ou nenhuma alteração possível. Isto pode ser demonstrado por meio de simulações de computador que modelo transições de um poro de fusão a partir de um início (ou seja, com um gargalo estreito) para um estado mais tarde 16,18. A P 2 S de uma vesícula fundido ligado à membrana do plasma através de um pescoço estreito (e com mais fez nas proximidades da interface) está previsto para ser maior, por exemplo, do que a de uma vesícula fundida com uma poro muito mais larga (onde a Será que está dentro da parte mais fraca do campo evanescente).
Neste artigo, discutimos como pTIRFM é implementada e utilizada para estudar as mudanças rápidas, localizadas em forma de membrana que ocorrem durante a fusão dos poros dilatação. Embora apenas uma aplicação é explicitamente discussed, os métodos podem ser estendidos para uma variedade de outros processos biológicos das células que directa ou indirectamente envolvem a remodelação da membrana.
TIRFM baseado na polarização detecta alterações rápidas e submicroscópicas na topologia da membrana. Implementar a técnica é relativamente simples, especialmente se TIRF ótica já estão em vigor. Tudo o que é necessário é uma placa de quarto de onda, dois cubos de polarização, e persianas para separar p-pol e iluminação s-pol caminhos. A posição precisa destes componentes na tabela é geralmente ditado pelo espaço disponível.
A fim de obter informação topológica de membrana, a sonda fluorescente utilizado deve intercala com uma orientação fixa, ou conhecido. A técnica, tal como descrito neste artigo, pressupõe o uso de corantes de carbocianina mas outros corantes, tais como FM1-43 14, pode também ser usado. O próprio procedimento de coloração membrana é simples. Células cultivadas exigem apenas uma breve exposição (menos de 10 segundos) a uma pequena quantidade de DII / fez para obter a rotulagem exuberante da membrana. Adicionando o excesso de corante leva à dispersão de luz AGGREGates no vidro que diminuem a qualidade de imagem. Over-incubação de células com corante leva a tingir interiorização que tem efeitos prejudiciais sobre a qualidade da imagem e, possivelmente, a viabilidade celular. Se uma célula é bem coradas, haverá distinção clara nas imagens de emissão de P e S. Como mostrado na Figura 2A, a emissão de P será nitidamente destacar as áreas da membrana que são oblíqua lamela (isto é, as bordas da pegada da célula), enquanto que a intensidade da emissão S será de aproximadamente uniforme ao longo da pegada da célula. Se uma distinção clara entre P e S não é aparente, então é possível que a célula é fracamente aderidas ao substrato ou a membrana celular não é saudável, e a célula não é usada para as experiências.
Nossos estudos anteriores que descrevem pTIRFM utilizado DII como a sonda de membrana fluorescente. Aqui, utilizamos o fez porque ele é adequado para experimentos com imagens de duas cores que empregam GFP / pHluorin como o outro fluoróforo. Nós excitar fez with um laser de 561 nm, em vez de 640 a laser nm (o que está mais perto de seu pico de excitação), porque os alvejantes fluoróforo mais rapidamente em 640 nm. Apesar do facto de que o laser de 561 nm é a cauda de DID do espectro de excitação publicada, a fluorescência emitida de forma eficiente. Outra vantagem do laser nm 561 é que ela excita tanto Dii e fiz o que nos permite usar a mesma configuração de polarização para ambas as sondas. Note-se que a orientação do fluoróforo na membrana irá afectar a interpretação de topologia de membrana. Por exemplo, se um fluoróforo foram orientadas com os seus dipolos transição perpendicular ao plano da membrana (em vez de em paralelo, ou aproximadamente paralelo, como é o caso com DII ou fiz), então as regiões não planares da membrana será mais facilmente destacada pelo S em vez a emissão de P.
Também foram descritas técnicas para o isolamento e a electroporação de células cromafins supra-renais de origem bovina. A célula chromaffin bovina é um excelente secretory modelo. Tem a vantagem de ser fácil de manter em cultura, em resposta a uma variedade de secretagogos, e possuindo grandes vesículas secretoras que podem ser facilmente visualizadas por microscopia de luz convencional. Para expressar as proteínas fluorescentes, as células são electroporados na suspensão antes do plaqueamento em placas de cultura tratadas com colagénio. Na nossa experiência, a eficiência de expressão é muito mais elevado do que com a electroporação tanto com Ca 2 +-fosfato ou reagentes LipofectAMINE. A desvantagem de electroporação é que ele requer mais células (como muitos não sobrevivem ao processo) e reagentes comerciais caros. Por razões que não são claras para nós, nem todos os membrana incorpora fez. Além disso, apenas uma fracção das células sobre o prato são transfectadas. Encontrar células que são transfectadas e estão manchados bem com DID pode ser demorado e é por isso otimizando as condições para coloração e eletroporação vale bem a pena o esforço.
Em resumo, este umArtigo descreve como pTIRFM é implementado para monitorar as deformações de membrana rápidas e localizadas que ocorrem durante a fusão de vesículas de núcleo denso em células cromafins bovina. Embora uma única aplicação é discutida, a técnica é ideal para o estudo de outros processos biológicos que envolvem alterações em forma de membrana, incluindo endocitose, a citocinese e a motilidade celular.
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa é apoiada por um Grant Scientist Nacional de Desenvolvimento (13SDG14420049) para AA da American Heart Association e fundos start-up da Universidade Estadual de Wayne. Somos gratos a Dr. Ronald W. Holz e Dr. Mary Bittner para fornecer conselhos sobre os preparativos adrenal bovina e Dr. Daniel Axelrod de assistência com a pTIRFM configurar e comentários úteis sobre o manuscrito. Syt-1 pHluorin foi utilizado com permissão do Dr. Gero Miesenböck (Universidade de Oxford). GCAMP5G foi obtida através Addgene. Agradecemos James T. Taylor, Tejeshwar Rao, Rachel L. Aikman e Praneeth Katrapti com a ajuda na otimização de diversas fases dos procedimentos descritos.
iXon3 EMMCD Camera | Andor | 897 | |
IX81 Inverted Microscope | Olympus | Side-mounted Filtercube Assembly | |
43 Series Ar-Ion Laser | CVI Milles Griot Laser Optics | 543-AP-A01 | Tunable to 488nm |
Sapphire 561 LP Diode Laser | Coherent | 561nm | |
Scanning Galvo Mirror System | Thorlabs | GVS102 | |
VC3 Channel Focal Perfusion System | ALA Scientific Instruments | ALA VC3X4PP | |
QMM Quartz MicroManifold | ALA Scientific Instruments | ALA QMM-4 | |
10 PSI Pressure Regulator | ALA Scientific Instruments | ALA PR10 | |
Manipulator | Burleigh | TS 5000-150 | |
Mounted Achromatic Quarter-Wave Plate | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
420-680nm Polarizing Beamsplitter Cube | Thorlabs | PBS201 | |
Six Station Neutral Density Wheel | Thorlabs | FW1AND | |
Stepper-motor Driven SmartShutter | Sutter Instruments | IQ25-1219 | |
HQ412lp Dichroic Filter | Chroma | NC255583 | Joins 488nm and 561nm beams |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 100mm VIS 0 | Diverges 488nm beam |
Coated Plano-Concave Lens | Edmund Optics | PCV 250mm VIS 0 | Diverges 561nm beam |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 125mm VIS 0 | Focuses both beams |
Coated Plano-Convex Lens | Edmund Optics | PCX 50mm VIS 0 | Cemented to filter cube assembly |
z488/561rpc Dichroic | Chroma | z488/561rpc | Filtercube dichroic |
z488/561_TIRF Emission Filter | Chroma | z488/561m_TIRF | Filtercube emission |
UIS2 60x Objective | Olympus | UPLSAPO 60XO | NA 1.37 |
Neon Transfection System | Invitrogen | MPK 5000 | |
MetaMorph Imaging Software | Molecular Devices | ||
DiI Membrane Dye | Invitrogen | V-22885 | For Alignment Purposes |
TH Liberase | Roche | 5401135001 | |
TL Liberse | Roche | 5401020001 | |
DNAse I Type IV from bovine | Sigma | D5025 | |
Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
DiD Membrane Dye | Invitrogen | D-7757 | |
Rhodamine | Invitrogen | R634 | |
.22 μm Membrane Syringe Filter Unit | Millipore | SLGS033SS | |
Fluoresbrite Polychromatic Red Microspheres | Polysciences | 19507 | 0.5 microns |
Immersion Oil | Sigma | 56822 | |
LabVIEW | National Instruments | Controlls galvo mirrors | |
Spinner Flask | Bellco | 1965-00250 |