Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex
Summary
Neurale Vorläufer Mitose ist ein kritischer Parameter der Neurogenese. Viel von unserem Verständnis der neuralen Vorläufer Mitose basiert auf der Analyse von festen Gewebe basiert. Live-Bildgebung in der embryonalen Hirnschnitten ist eine vielseitige Technik zur Mitose mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung in einer kontrollierten Umgebung zu beurteilen.
Abstract
Obwohl von kurzer Dauer ist Mitose ein komplexes und dynamisches mehrstufiges Verfahren grundlegend für die Entwicklung der Organe, einschließlich des Gehirns. In der sich entwickelnden Großhirnrinde kann abnorme Mitose von neuronalen Vorläuferzellen Defekte in der Gehirngröße und Funktion führen. Daher besteht ein kritischer Bedarf an Werkzeugen, die Mechanismen der neuralen Vorläufer Mitose verstehen. Kortikale Entwicklung in Nagetieren ist eine herausragende Modell für die Untersuchung dieses Prozesses. Neurale Vorläufer Mitose wird häufig in festen Hirnschnitten untersucht. Dieses Protokoll wird im Detail beschreiben einen Ansatz für die Live-Darstellung der Mitose in ex vivo embryonalen Hirnschnitten. Wir werden die wichtigsten Schritte für dieses Verfahren zu beschreiben, welche sind: Gehirn-Extraktion, Gehirn Einbettung Vibratom Schnitte von Hirnschnitten, Färbung und Kultivierung von Scheiben und Zeitraffer-Bildgebung. Wir werden dann zeigen und beschreiben im Detail, wie der nach dem Erwerb der Mitose Analyse durchzuführen. Wir sind repräsentative Ergebnisse from dieser Test mit dem Vitalfarbstoff Syto11 transgene Mäuse (Histon H2B-EGFP und Centrin-EGFP) und in utero Elektroporation (mCherry-α-Tubulin). Wir werden diskutieren, wie dieses Verfahren am besten optimiert werden kann und wie sie für die Untersuchung der genetischen Regulation der Mitose geändert werden. Live-Imaging der Mitose in Hirnschnitten ist ein flexibler Ansatz zur Bewertung der Auswirkungen von Alter, Anatomie, und genetische Störung in einer kontrollierten Umgebung, und eine große Menge von Daten mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu erzeugen. Daher dieses Protokoll wird die bestehenden Werkzeuge für die Analyse von neuronalen Vorläufer Mitose ergänzen.
Introduction
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist zu beschreiben, wie die Live-Darstellung von neuronalen Vorläufer Mitose in der embryonalen Hirnschnitten durchzuführen. Mit Live-Bildgebung von Hirnschnitten in Kultur, bietet das Protokoll eine einfache Methode, um mehrere Aspekte der Mitose in neuralen Vorläuferzellen in einem Umfeld sehr ähnlich zu einem in-vivo-Einstellung testen. Es kann an Gehirnen von mutierten Tieren und / oder Gehirn, die mit in utero Elektroporation 1-5 manipuliert wurden) angewendet werden. Diese Technik eignet sich auch hervorragend, um die Wirkung von pharmakologischen Mitteln auf neuralen Vorläufer 'Mitose zu testen, durch einfaches Hinzufügen eines Mittels zu dem Kulturmedium. In der Summe wird dieser Artikel machen eine technisch anspruchsvolle Protokoll zugänglich, die das Studium der Neurogenese.
Während der Neurogenese, unterschiedliche neuronale Vorläuferpopulationen unterziehen präzise Divisionen zu Neuronen, die schließlich zu den sechs kortikalen Schichten der erwachsenen Neocortex 08.06 beitragen erzeugen. Früh in kortikalen Entwicklung, dehnt sich die neuralen Vorläuferpool neuroepithelialen (NE) Zellen teilen sich symmetrisch zur Selbsterneuerung. NE Zellen wandeln dann in radiale Gliazellen (RGZ). Zunächst RGZ symmetrisch teilen, um zwei neue RGZ produzieren, jedoch während der Großteil der Neurogenese, ist Haupt-Modus der Aufteilung RGZ 'asymmetrisch. Bei der asymmetrischen Teilung, gibt ein RGC zu einer neuen RGC und entweder mit einem post-mitotischen Neuronen oder eine spezialisierte Vorläufer (entweder eine kurze neurale Vorläufer (SNP), einem äußeren radialen Gliazellen (ORG) oder einem Zwischenvorläufer (INP) 2,3,7,9. INPS, SNPs und ORGs können dann erzeugen Neuronen an der Unter ventrikuläre, ventrikuläre und basalen Regionen des Kortex. Daher ist jeweils Zellteilung der Vorläuferzellen eine grundlegende Verfahren zur Erzeugung von Neuronen des Neocortex.
Zahlreiche Studien weisen auf eine Korrelation zwischen der spezifischen Merkmale der mitotischen RGZ und das Schicksal der Tochterzellen. Haydar et al. Und Takahashi et al.haben gezeigt, dass die Dauer und RGC mitotischen Zellzyklus Anstieg der Neurogenese als Erlös, hallte eine Feststellung, in Folgestudien 10-13. Eine Reihe von Studien haben vorgeschlagen, dass mitotischen Spindel-Orientierung bezüglich des Ventrikels beeinflusst Aspekte der Neurogenese und Kortikogenese, einschließlich Arten von Neuronen erzeugt und Lage der Nachkommen im Gehirn, jeweils 3,10,14-16. Ob Spaltebene Orientierung Zelle Schicksal direkt beeinflusst, ist umstritten, aber die Schlussfolgerung bleibt, dass diese Parameter mitotische Auswirkungen der Neurogenese. Weitere unterstreicht die Bedeutung der Mitose ist die Beobachtung, dass viele Gene, die in der Mechanik der Mitose beteiligt sind entscheidend für die Neurogenese und für die richtige Entwicklung des Gehirns 17-20.
Mitose ist ein dynamischer Prozess, aber bis heute die meisten Studien Detaillierung neuralen Vorläufer Mitose nutzen Analyse der Gewebeschnitten oder Bildgebung von neuralen Vorläuferzellen durch in vitro-Zellkultur. So sind die Mainstream-Methoden, um beurteilen zu können Mitose nur eine Momentaufnahme dieses Prozesses und nicht zu entdecken, wie Zellen verhalten sich in einem Gewebe. Live-Darstellung von neuralen Vorläufer Mitose ist zunehmend ein wichtiges Werkzeug für das Verständnis der neuralen Vorläuferfunktion geworden. Beispiele finden Sie diese Verweise 4,8,10,21-25. Mehrere hervorragende Protokolle für die Vorbereitung und Bildgebung von Hirnschnitten 26,27 erschienen. Doch bis heute hat ein umfassendes Protokoll für Abbildung und Analyse der Mitose nicht beschrieben worden, noch im Video demonstriert.
Diese Technik bietet einige wesentliche Vorteile gegenüber Fest Analyse von Hirnschnitten. Zeitraffer-Analyse von Hirnschnitten ermöglicht die Erzeugung von deutlich mehr Datenpunkte, die in einer flexiblen Weise analysiert werden kann. Zuerst werden die Daten an den einzelnen Zeitpunkten im Verlauf von mehreren Minuten oder mehreren Stunden gesammelt. Man kann einzelne Zeitpunkte (eine statische Montage erstellen) oder analysierenkann zu verschiedenen Zeitpunkten in Filmen zu kombinieren. Zweite konfokale Bildgebung von Scheiben ermöglicht die Erzeugung von Daten mit unterschiedlichen Abschnitten in Z Hirnschnitten. Als Ergebnis können die einzelnen Abschnitte analysiert werden. Alternativ können Stapel von einzelnen Abschnitte in eine maximale Intensitätsprojektion kombiniert werden. Drittens wird die Analyse im Rahmen eines Gewebes durchgeführt, offenbart, wie Zellteilung relativ zu benachbarten Zellen und Strukturen. Viertens ist es ideal um die Analyse von Mutanten, die einige Hinweise von mitotischen Defekte zeigen geeignet. Gemeinsam dieses Protokoll wird zur Klärung kritischen Schritte, um Ermittler, die für die Durchführung von Live-Bildgebung neuronaler Vorläufer Mitose in den eigenen Labors wollen helfen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Hauptvorteil des Protokolls, die wir beschrieben haben, ist, dass sie eine dynamische zeitliche Auflösung der Mitose von neuronalen Vorläuferzellen. Typischerweise Assays zur Mitose im sich entwickelnden Gehirn visualisiert werden unter Verwendung von Immunfluoreszenz von fixierten Gewebeschnitten. Aber dieser Ansatz stellt nur eine Momentaufnahme der Mitose zu einem Zeitpunkt.
Es gibt mehrere Schritte, die am kritischsten für die Abbildung der Mitose in Hirnschnitten sind: 1) Die Geh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Mittel aus NINDS / NIH, R00-NS064197 und NINDS / NIH, R01NS083897 (sowohl auf DLS).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
| 50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
| Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
| Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
| FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
| EGF | for culture medium | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1M (pH7.4) |
| 2.5M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
| 0.9M NaHC03 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
| low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
| Loctite 404 glue | Loctite 404 | 46551 | keep at 4˚C |
| syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
| 3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
| glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
| petri dishes | for dissection of the embryos | ||
| digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
| spatula | to transfer brains | ||
| paintbrush | alternative to transfer brains | ||
| vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
| dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
| imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |
References
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