개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상
Summary
신경 전구 세포의 유사 분열은 신경의 중요한 매개 변수입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열에 대한 우리의 이해의 대부분은 고정 된 조직의 분석을 기반으로합니다. 배아 뇌 조각의 라이브 영상은 통제 된 환경에서 높은 공간적 해상도로 유사 분열을 평가하기 위해 다양한 기술입니다.
Abstract
짧은 기간이지만, 유사 분열은 뇌를 포함한 장기의 개발을위한 기초 복잡하고 역동적 인 여러 단계의 프로세스입니다. 개발 대뇌 피질에서 신경 전구 세포의 비정상적인 분열이 뇌의 크기와 기능에 결함을 일으킬 수 있습니다. 따라서, 신경 전구 세포의 유사 분열의 메커니즘을 이해하는 도구를위한 중요한 필요가있다. 쥐의 대뇌 피질의 발달 과정을 연구하기위한 뛰어난 모델입니다. 신경 전구 세포의 유사 분열은 일반적으로 고정 된 뇌 부분에서 검토된다. 이 프로토콜은 자세히 생체 배아 뇌 조각의 유사 분열의 라이브 영상에 대한 접근 방법을 설명합니다. 뇌 추출, 뇌 매립, 뇌 조각의 vibratome 절편, 염색과 조각의 배양 및 시간 경과 영상 : 우리는 포함하는이 절차의 중요한 단계를 설명합니다. 우리는 그 입증하고 유사 분열의 취득 후 분석을 수행하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 대표적인 결과의 fr을톰 중요한 염료 Syto11, 형질 전환 마우스 (히스톤 H2B-EGFP와 centrin-EGFP), 및 자궁 일렉트로에 (mCherry-α-튜 불린)를 사용하여이 분석. 우리는이 방법이 가장 최적화 할 수있는 방법과 유사 분열의 유전자 규제의 연구를 위해 수정하는 방법을 설명합니다. 뇌 조각에서 유사 분열의 라이브 영상은 제어 된 환경에서 연령, 해부학 적 및 유전 적 교란의 영향을 평가하기 위해, 높은 공간적 해상도를 가진 많은 양의 데이터를 생성하는 유연한 방법이다. 따라서이 프로토콜은 신경 전구 세포의 유사 분열의 분석을 위해 기존 도구를 보완합니다.
Introduction
이 프로토콜의 전반적인 목표는 배아 뇌 조각에 신경 전구 세포의 유사 분열의 라이브 영상을 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. 문화 뇌 조각의 라이브 영상을 사용하여,이 프로토콜은 생체 설정에 매우 유사한 환경에서 신경 전구 세포에서 유사 분열의 여러 측면을 검정하는 간단한 방법을 제공한다. 그것은) 자궁 일렉트로에 1-5을 조작 한 돌연변이 동물 및 / 또는 뇌의 두뇌에 적용 할 수 있습니다. 이 기술은 단순히 배지에 제를 첨가함으로써, 신경 전구체 '에 유사 분열되는 약물의 효과를 시험하는 것이 이상적이다. 결론적으로,이 문서가 신경을 공부하는 사람들에게 기술적으로 도전적인 프로토콜에 액세스 할 수 있도록합니다.
신경 동안 별개의 신경 전구 인구는 결국 6-8 신피질 성인의 여섯 대뇌 피질의 층에 기여하는 신경 세포를 생성하는 정확한 분열을 받다. neuroepithelial (NE) 세포가 자기 갱신에 대칭 적 분할로 초기 대뇌 피질의 개발, 신경 전구체 풀을 확장합니다. NE 세포는 레이디 얼 glial 세포 (망막 신경절)로 변환합니다. 초기 망막 신경절 그러나 신경의 대부분 동안, 분열의 망막 신경절의 주요 모드 비대칭, 두 개의 새로운 망막 신경절을 생산하기 위해 대칭 적으로 나눕니다. 비대칭 부문에서 1 RGC는 새로운 RGC와 하나 후 유사 분열 신경 세포, 또는보다 전문적인 전구 (하나 짧은 신경 전구체 (SNP), 바깥 지름의 아교 (ORG), 또는 중간 전구 (INP)에 상승을 제공합니다 2,3,7,9. INPS, SNP를, 그리고 개 기관은 다음 하위 심실, 심실에 신경을 생성 할 수 있고, 대뇌 피질의 기초 영역은 각각. 따라서, 전구 세포의 세포 분열은의 신경 세포를 생성하는 기본 과정이다 신피질.
많은 연구는 특정 유사 분열 망막 신경절의 특성과 딸 세포의 운명 사이의 상관 관계를 가리 킵니다. 하이다르 등.와 다카하시 외 여러분.RGC의 유사 분열의 기간과 신경이 진행됨에 따라 세포주기의 길이 증가, 발견은 연구 10-13를 따라있는 에코 것으로 나타났습니다. 연구의 수는 심실에 방추사 방향의 상대는 각각 뇌에서 생성 된 신경 세포의 종류와 자손의 위치, 3,10,14-16 등의 신경과 corticogenesis의 측면을, 영향을 미치는 것을 제안했습니다. 절단 평면 방향이 직접 세포의 운명에 영향을 미치는 여부는 논란의 여지가 있지만, 결론은이 유사 분열 매개 변수의 영향을 신경 남아있다. 또한 유사 분열의 중요성을 강조하는 것은 유사 분열의 메커니즘에 관련된 많은 유전자가 신경에 대한 적절한 뇌 발달에 중요한 17-20 있다는 관측이다.
유사 분열은 역동적 인 과정입니다, 아직 날짜에 신경 전구 세포의 유사 분열을 자세히 대부분의 연구는 체외 세포 배양을 통해 고정 된 조직 절편 또는 신경 전구 세포의 이미지 분석을 이용. 따라서, 유사 분열을 평가하는 주류의 방법은이 프로세스의 스냅 샷을 제공하고 세포 조직에서 행동하는 방법을 발견하지 못한다. 신경 전구 세포의 유사 분열의 라이브 영상은 점점 더 신경 전구의 기능을 이해하기위한 중요한 도구가되고있다. 예를 들어 이러한 참조를 참조하십시오 4,8,10,21-25. 몇 가지 눈에 띄는 프로토콜은 준비와 뇌 조각 (26, 27)의 영상에 발표되었다. 그러나 현재까지, 이미징 및 유사 분열의 분석을위한 포괄적 인 프로토콜은 설명되지도 비디오에서 보여 주었다.
이 기술은 뇌 부분의 고정 분석을 통해 몇 가지 중요한 이점을 제공합니다. 뇌 조각의 시간 경과 분석은 유연한 방식으로 분석 할 수있는 훨씬 더 많은 데이터 포인트의 생성을 가능하게한다. 첫째, 데이터는 몇 분 또는 몇 시간의 과정을 통해 각각의 시점에서 수집됩니다. 하나는 각각의 시점 (정적 몽타주를 만들려면) 또는 분석 할 수 있습니다영화로 서로 다른 시간의 포인트를 결합 할 수 있습니다. 둘째, 조각 공 촛점 이미징은 뇌 조각의 다른 Z 섹션에서 데이터의 생성을 가능하게한다. 결과적으로, 각각의 섹션은 분석 될 수있다. 또한, 개별 섹션의 스택은 최대 강도 투사로 결합 할 수 있습니다. 셋째, 분석 세포는 이웃 세포와 구조를 기준으로 분할하는 방법을 공개, 조직의 맥락에서 이루어집니다. 넷째, 이상적으로 유사 분열 결함의 증거를 보여 돌연변이의 분석에 적합합니다. 함께이 프로토콜은 자신의 실험실에서 신경 전구 세포의 유사 분열의 라이브 영상을 수행하고자하는 연구자를 지원하기 위해 중요한 단계를 명확히하는 데 도움이 될 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리가 기술 한 프로토콜의 주요 장점은 신경 전구 세포의 유사 분열의 동적 시간 해상도를 제공하는 것입니다. 일반적으로, 두뇌 개발에 유사 분열을 시각화 분석은 고정 된 조직 절편의 면역을 사용하여 수행됩니다. 그러나이 방법은 한 시점에서 유사 분열의 스냅 샷을 제공한다.
뇌 조각의 유사 분열 이미징을위한 가장 중요한 몇 가지 단계가 있습니다 : 1) 뇌 조각은 전송…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 NINDS / NIH, R00-NS064197 및 NINDS / NIH, R01NS083897 (DLS에 모두)에서 자금을 인정합니다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 100X N2 | Life technologies | 17502048 | for culture medium |
| 50X B27 without vitamin A | Life technologies | 12587010 | for culture medium |
| DMEM/F12 | Life technologies | 11320033 | for culture medium |
| Heat-inactivated horse serum | Sigma Aldrich | H1138-500ml | for culture medium |
| Heat-inactivated calf serum | Sigma Aldrich | F4135-500ML | for culture medium |
| FGF | R&D Sytems | 3139-FB-025 | for culture medium |
| EGF | for culture medium | ||
| 10X HBSS | Life technologies | 14065-056 | for the dissection of the embryos |
| Hepes Free Acid | Sigma Aldrich | H4034 | dilute to 1M (pH7.4) |
| 2.5M D-Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | for the dissection of the embryos |
| 0.9M NaHC03 | Life technologies | 25080-094 | for the dissection of the embryos |
| low-melting agarose | Fisher | BP165-25 | for generating slices |
| Loctite 404 glue | Loctite 404 | 46551 | keep at 4˚C |
| syto11 | Life technologies | S7573 | Make 5µl aliquots |
| 3 mg/ml collagen type I | Life technologies | A1048301 | for culturing slices |
| glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | for culturing slices |
| petri dishes | for dissection of the embryos | ||
| digital thermometer | to measure the temperature of the agarose | ||
| spatula | to transfer brains | ||
| paintbrush | alternative to transfer brains | ||
| vibratome | Leica | VT1000s | for generating slices |
| dissecting microscope | dissecting out embryos | ||
| imaging microscope | A confocal microscope is required, it needs to be equipped with an incubation chamber |
References
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