Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Reproduzierbarkeit der einem in vitro-Modell mit BBB eine Ratte syngenen Co-Kultur von Endothelzellen und Astrozyten zu validieren. Die Endothel-Zellschicht vorgestellt hohen und niedrigen TEER LY Durchlässigkeit. Expression spezifischer TJ Proteinen wurden funktionellen Antworten zu Entzündungen und Funktionalität von Transportern und Rezeptoren untersucht.
Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) spezifisch reguliert molekularen und zellulären Fluss zwischen Blut und Nervengewebe. Unser Ziel war die Entwicklung und Charakterisierung eines hoch reproduzierbare syngenen Ratten in vitro-Modell der BHS mit Co-Kulturen von primären Ratten-Gehirn-Endothelzellen (RBEC) und Astrozyten an Rezeptoren in Transzytose durch die endotheliale Zellschicht beteiligt studieren. Astrozyten wurden durch mechanische Präparation folgenden Trypsinverdau isoliert und für die spätere Co-Kultur eingefroren. RBEC wurden von fünf Wochen alten Ratte Kortex isoliert. Die Gehirne wurden von Hirnhaut und der weißen Substanz gereinigt und folgende enzymatische Verdauung mechanisch dissoziiert. Danach wurde das Gewebe-Homogenat in Rinderserumalbumin zentrifugiert, um Bruchstücke von Gefäßnervengewebe zu trennen. Die Gefäßfragmente erfuhr eine zweite enzymatische Verdauung freien Endothelzellen aus ihren extrazellulären Matrix. Die restlichen kontaminierenden Zellen wie Perizyten wurden feitere durch Ausplattieren der Mikrogefäßfragmente in Puromycin-haltigem Medium eliminiert. Sie wurden dann auf Filter für Co-Kultur mit Astrozyten am Boden der Vertiefungen gezüchtet agiert. RBEC ausgedrückt hohe Tight Junction (TJ) Proteine wie Occludin, Claudin-5 und ZO-1 mit einem typischen Lokalisation an den Zellgrenzen hinweg. Die transendotheliale elektrischen Widerstand (TEER) von Hirn endothelialen Monoschichten, was die Dichtheit der TJs erreicht 300 Ohm · cm 2 im Durchschnitt. Die Endothelzellen Permeabilitätskoeffizienten (Pe) für Lucifer Yellow (LY) war in hohem Maße reproduzierbar mit einem Durchschnitt von 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Gehirn-Endothelzellen in Monoschichten organisiert ausgedrückt Effluxtransporters P-Glykoprotein (P-gp), zeigte einen polarisierten Transport von Rhodamin 123, einem Liganden für P-gp und zeigten spezifische Transport von Transferrin-Cy3 und DiILDL durch die endotheliale Zellschicht. Abschließend bieten wir ein Protokoll für die Einrichtung eines in-vitro-BBB-Modell, das in hohem Maße reproduzierbar durch die Methoden der Qualitätssicherung ist, und das ist für die Forschung auf BBB Transporter und Rezeptoren.
Viele Medikamente entwickelt, um das Zentrale Nervensystem (ZNS) zu behandeln Erkrankungen sind nicht imstande, die Hirnparenchym in therapeutisch relevanten Konzentrationen zu erreichen. Die BBB schützt Gehirn Nervengewebe, die durch Schwankungen der Plasma-Zusammensetzung, das aus Krankheitserregern, und unterhält Homöostase des Hirnparenchym durch die Einschränkung nicht-spezifischen Ionenfluss, Peptide, Proteine und sogar Zellen in und aus dem Gehirn ein.
BBB Eigenschaften durch intime Nähe und Übersprechen zwischen den spezialisierte Klasse Hirnkapillarendothelzellen und benachbarte Elemente der Neuro Glia-Kreiseinheit (NGVU) wie Neuronen induziert und aufrechterhalten wird, Gliazellen (Astrozyten genauer Endfüßchen) und Perizyten umhüllt in der Basalmembran, die hauptsächlich aus Kollagen Typ IV, Fibronectin, Laminin und Proteoglykane 2,3 besteht. Perizyten decken etwa 22 – 32% des Endothels an der Kapillare Ebene und spielen eine wichtigeRolle bei der Regulation der Proliferation Endothel, Angiogenese-und Entzündungsprozessen. Endothelzellen bilden eine kontinuierliche Bahn für die innere Oberfläche der Kapillaren. Sie werden von TJs, das eine bandartige Struktur an der apikalen Bereich bilden und dazu beitragen, dass Polarisierungszelle verbunden. Astrozyten regulieren BBB Eigenschaften und sind Quellen von wichtigen Regulationsfaktoren wie TGF-β, GDNF, bFGF und IL-6. Astrozyten in GFAP mit unvollständiger Funktionalität mangelhaft sind nicht in der Lage, um BBB-Eigenschaften 4 zu regeln. Neuronen nicht direkt strukturell in der Bildung der BBB beteiligt, sondern auch regulieren wichtige Aspekte der Proteinexpression und BBB Funktionen 5.
Um die Struktur, Physiologie und Pathologie des BBB weiter untersuchen, wurden in vitro-Modelle der Blut-Hirn als Forschungswerkzeuge entwickelt. Gehirn-Endothelzellen wurden aus verschiedenen Spezies extrahiert wurden, in vitro-Modelle zu implementieren BBB basierendauf niedrigen Gang Primärkulturen aus Rinder 6,7, Schweine 8,9, 10,11,12 Ratte, Maus 13 und auch menschliche 14,15. Diese Modelle sind bekannt, die in vivo BBB nachahmen insbesondere wenn co-kultiviert mit Glia-Zellen aus Ratten-oder Maus-und / oder Perizyten 16,12, und / oder neuronalen Vorläuferzellen stamm 17 Astrozyten und / oder Neuronen 18. Die "im Labor"-Modelle sind oft von Nagetieren hergestellt, weil sie in vitro / in vivo-Experimenten und-Vergleiche und / oder der Untersuchung von Hirnendothelzellen aus transgenen Modellen 19 erzeugt.
Neu in vitro BBB-Modelle entwickelt wurden auch entwickelt, um vorherzusagen Aufnahme in das Gehirn von möglichen ZNS-Wirkstoffkandidaten vor der in-vivo-Tests 15,20,21,3,6,22,11,23. In vitro BBB-Modelle sind in der Regel verwendet, um zu vergleichen der Transport von Medikamenten mit: i) bekannt Eindringen in das ZNS oder mit low Durchlässigkeit über die BBB und keine zentralen Wirkungen, und ii) die scheinbare Pe der gleichen Medikamente in Tiermodellen der gleichen Spezies gemessen. Die Drogen, die leicht passieren die BBB sind meist lipophilen und überqueren die Gehirn endothelialen Zellmembranen durch Lipid-vermittelte freie Diffusion (Koffein, Carbamazepin, etc.). Die negativ transportiert Medikamente wie Digoxin, Verapamil oder Cyclosporin A aktiv durch Hirnendothelzellen Effluxtransporter wie P-gp extrudiert. Viele der neu entwickelten therapeutischen Moleküle sind jedoch Biopharmazeutika, wie rekombinante Proteine, monoklonale Antikörper oder siRNAs. Die meisten von ihnen die BBB nicht kreuzen durch: i) Fehlen spezifische Transporter, und ii) die dicht gepackten Schicht von Endothelzellen, die hochmolekulare Moleküle aus unterziehen parazellulären Durchgang zu verhindern. Mit dieser Grenzen, "Trojanische Pferd" Strategien wurden unter Verwendung von Vektoren (Antikörper, Peptide) gegen bekannte Rezeptoren an der BBB, beteiligt i implementiertn-Rezeptor-vermittelten Transport oder Transzytose (RMT), wie die Transferrin (Tf)-Rezeptors (TfR), der Insulin-Rezeptor (IR) oder Mitglieder der LDL-Rezeptor (LDLR)-Rezeptorfamilie verwandt (LDLR, LRP1). Solche Rezeptoren wurden auf isolierte Gehirn Kapillaren und in der BBB wurden in vivo 24,25 gefunden. Transkriptionsprofile für diese Rezeptoren, insbesondere diejenigen der Familie LDLR wurden analysiert und verglichen zwischen Endothelzellen des Gehirns und Gehirn-Endothelzellen kokultiviert mit Astrozyten im Gehirn oder Kapillaren unmittelbar nach ihrer Extraktion aus Gehirn 26. Pardridge 24 geöffnet, das Feld mit dem OX-26 Antikörper gegen den Transferrinrezeptor (TfR), gefolgt von Antikörper gegen den Insulinrezeptor und den Insulin-Wachstumsfaktor-Rezeptor 27,28. Mit diesen Antikörper basierte Vektoren, hat ArmaGen Technologies einen BBB molekularen Trojaner-Plattform-Technologie über die BBB 29 entwickelt, um Medikamente zu liefern, einschließlich Proteinen. DieLiteratur ist reich an Daten, die LRP1-Expression in Endothelzellen des Gehirns und seiner Rolle als leistungsfähiges endozytischen / Scavenger-Rezeptor. Western-Blot-Analyse ergab, dass LRP1 wird in Fraktionen in Hirnkapillaren angereichert und im Rattenhirn-Kapillarendothelzellen 30 ausgedrückt. Unternehmen wie Angiochem Ziel LRP1 mit von Aprotinin abgeleitetes Peptid-Vektoren, die effiziente Wirkstoff Zustrom über die BBB 31 zu fördern. Allerdings ist auch in LRP1 aktiven Transport von Aß und seine Auslauf / Abstand von Hirnparenchym, um den Blut 32 beteiligt. Solche Daten beinhalten LRP1 in einem bidirektionalen Transport über die BBB in Abhängigkeit von seiner Liganden. biOasis entwickelt die Transcend Technik unter Verwendung eines Proteins Melanotransferrin für den Transport von biologischen wie lysosomalen Enzymen und Antikörpern durch die BHS 33 während VECT-HORUS entwickelt Peptidvektoren, die LDLR 34 zielen. Es werden Daten darauf hindeutet, dass die LRP und LDL-Rezeptor kann zum Unterschied zu transportierenerent Moleküle wie lysosomale Enzyme 35,36 oder Nanopartikel-Komplexen über die BBB 37.
Unsere Interessengebiet ist Arzneimittelabgabe an das ZNS mit Vektormolekülen und vektorisiert Drogenkandidaten für die Behandlung von ZNS-Erkrankungen. Insbesondere weist Arzneimittelabgabe über die BBB in den Kontext der Neuroentzündung, ein Prozess, in dessen Umfang variieren kann berücksichtigt werden, aber das ist wahrscheinlich für alle ZNS-Läsionen und Erkrankungen wie Enzephalitis, multipler Sklerose, Alzheimer-Krankheit usw. Neuroinflammation ist mit BBB-Entzündung und möglicherweise mit Veränderungen in Physiologie und Durchlässigkeit BBB bedenkt, dass parazellulären und transzellulären Transport in pathologischen Bedingungen 38,39,40,41,42,43 verstärkt werden verbunden. Zum Beispiel TNF-α, TWEAK und andere Cytokine modulieren Entzündung und Experimenten mit in vitro BBB Modelle haben gezeigt, dass sie den parazellulären Eigenschaften th zu veränderne endotheliale Zellschicht 38,39,40 und TNF-α führt auch zu einem Anstieg der transzellulären Transport von LDL 41, Holotransferrin 42 und 43 Lactoferrin.
Unser Ziel war die Entwicklung und Charakterisierung ein optimiertes und hoch reproduzierbare Ratte syngenen BBB-Modell mit Co-Kulturen von primären Gehirn Endothelzellen und Astrozyten. Wir haben 5 Wochen alt und neonatalen Wistar-Ratten für Gehirn-Endothelzellen-Produktion und Astrozyten-Produktion auf. Eine Herausforderung war es, ein Protokoll, das die Produktion von "Wochen reproduzierbar" BBB-Modelle zu etablieren. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde jeder Schritt der Produktion Protokoll an festen Tagen in der Woche durchgeführt, ausgehend vom Gehirn Mikrogefäß Produktion am Mittwoch der ersten Woche. Dissektionen wurden fast jede Woche in den letzten 3 Jahren durchgeführt. Um die Reproduzierbarkeit der Kulturen weiter zu verbessern, wurde ein Qualitätssicherungssystem etabliert. Alle Reagents und Chemikalien wurden in einer Datenbank (Datum der Eintragung, Lager, Verfalldatum, etc.) verwiesen.
Das Modell wurde nach einer Reihe von Kriterien, wie Endothelzellen Organisation und Reinheit aus, TEER, LY Durchlässigkeit, Reaktion auf pro-inflammatorische Mittel, qualitative und quantitative Ausdruck der TJ-Proteine, die Funktionalität von Efflux-Transporter wie P-gp, und Rezeptoren in Transzytose durch die endotheliale Zellschicht, wie die TfR oder LDL-Rezeptor beteiligt.
Wir beschreiben die Umsetzung eines Wochen reproduzierbare Protokoll für die Isolierung und Beschichtung von Mikrogefäßen des Gehirns, nach der Reinigung und der Kultur der RBEC und weiteren Aufbau von Co-Kulturen mit primären Ratten-Astrozyten, ein in vitro-Modell mit BBB BBB charakteristischen Eigenschaften zu erzeugen.
Erfolgreich Gründung in-vitro-Kulturen BBB standardisiert erfordert optimale Bedingungen in den mehreren aufeinander folgenden Schritte des Prozesses. Das Modell wurde (a) optimiert, um die niedrigsten parazellulären Permeabilität, die der "Heilige Gral" der in-vitro-Modelle BBB bleibt, und (b) für Auslauf und RMT Mechanismen validiert erhalten.
Produktion, Reinigung und Proliferation von RBEC
Die größte Herausforderung bei der Kultivierung RBEC ist, um die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Kulturen zu erreichen. Standardisierung des Protokolls erfordert hochwertige Werkzeuge für disAbschnitt, hochwertige Reagenzien und Respekt Reagenz Ablaufdaten. Der Versuchsleiter muss in der Mikro-Dissektion unter Stereomikroskop für die schnelle Entfernung der Hirnhäute und große Schiffe aus der Kortexoberfläche qualifizierte werden. Sobald das Gehirn isoliert und mechanisch dissoziiert, ist eine der großen Herausforderungen, die optimale enzymatische Verdauung der frisch isolierten Gehirnmikrogefäßen. Die Art und Qualität der verwendeten Enzyme ist kritisch. Eine Mischung aus Collage Typ I und II und Dispase in hoher Konzentration mit geringer Variabilität zwischen den Chargen verwendet. Wichtig sind auch die Dauer der enzymatischen Verdauung und das Verhältnis zwischen Enzymkonzentration / Gewebegewicht / Volumen der Verdauung. Die beste Ausbeute von Gehirnmikrogefäß-Produktion wurde mit dem Äquivalent von 1 Kortex des Gehirns in 1 ml Collage erhalten / Dispase bei 60 ug / ml während der beiden Aufschlüsse 30 Minuten und 1 Stunde mischen sind.
Ebenfalls kritisch ist die Beseitigung von verunreinigenden Zells (Astrozyten und vor allem Perizyten). Diese Zellen vermehren sich bei höheren Rate als Endothelzellen und nicht tight junctions zu etablieren mit dem letzteren, wodurch die Einrichtung einer homogenen Zellschicht mit guten parazellulären Restriktions. In Anbetracht, dass Gehirn-Endothelzellen exprimieren deutlich höhere Efflux-Pumpen, insbesondere P-gp im Vergleich zu den anderen Zelltypen in Mikrogefäßen gefunden, tolerieren sie besser die ansonsten toxischen Konzentrationen von P-gp-Ligand Drogen, während nicht-Endothelzellen werden eliminiert. Puromycin-Behandlung bei 4 ug / ml für die ersten zwei Tage wurde durch zwei weitere Tage bei 2 ug / ml, gefolgt gute Endothelzellen Reinheit zu erhalten. Diese Auswahl kann auch Endothelzellen begünstigen im Vergleich zu denen von Venen, Pre-Kapillare Arteriolen oder größere Mikrogefäße und führen zu strengeren Monoschichten. Darüber hinaus ist die Verwendung von armes Plasma abgeleiteten Rinderserum eine Notwendigkeit Reinkulturen von Endothelzellen 47,48 erhalten. Das Plasma-derIved Serum fehlt Plättchenwachstumsfaktor (PDGF), die mitogen für Fibroblasten ist für glatte Muskelzellen und Perizyten daher.
Wir haben beobachtet, dass die Behandlung von Kunststoff und Filter mit einer Mischung aus Kollagen Typ IV von Mäusen und menschlichem Fibronectin ergibt einen erheblichen Vorteil, mit einem 2-fachen Anstieg der Proliferation Ausbeute im Vergleich mit der traditionellen empfohlen Kollagen Typ I aus Rattenschwanz. Wichtige Hinweise für die Zellproliferation von der extrazellulären Matrix wie beispielsweise Integrin-und Wachstumsfaktor (bFGF) Aktivierung 49 vorgesehen. Pufferkonzentration und pH-Wert der Kulturmedien beschrieben worden sind, positiv auf die parazelluläre Dichtigkeit 50 auswirken, und wir beobachteten eine bessere Reproduzierbarkeit der Kulturen mit dem Zusatz von HEPES-Puffer mit 5 mM.
Differenzierung von RBEC: Co-Kultur-Establishment auf Filter einfügen
Nach Gehirn-Endothelzellen haben been gereinigt und wurden 6 Tage lang vermehrt, können sie auf Filtern plattiert werden. Zellbeschichtung mit hoher Dichte ist entscheidend, um eine perfekte Monoschicht zu erhalten. Ein Aussaatdichte von 160×10 3 Zellen pro 12-Well-Platte Filter notwendig und ausreichend war, um eine Monolayer 24 Stunden nach der Aussaat zu erhalten. Allerdings ist Isolierung von primären Gehirn Endothelzellen aus ihrer Umgebung ein Paradox in den Bau einer BBB-in vitro-Modell, wie es ist bekannt, dass primäre Zellen und insbesondere Gehirn Endothelzellen, sind stark von ihrer Umgebung reguliert und induktive Faktoren hergestellt die verschiedenen umliegenden Zelltypen. Gehirn-Endothelzellen allein kultiviert schnell dedifferenzieren und verlieren einige spezifische Hirn endotheliale Marker. Somit sollte primären endothelialen Zellen bei niedrigen Passage (P1) zumindest teilweise verwendet werden und neu verbunden, mit ihrer Umgebung durch Co-Kultur mit Astrozyten oder Medium durch Astrozyten 47,51 konditioniert. Dies giltgilt für Astrozyten-Differenzierung als Gehirn-Endothelzellen und Astrozyten sind in Zwei-Wege-Induktion beteiligt. Kultivierung RBEC mit Astrozyten führte zu starken Induktion von interendothelialen TJ 52,23. Die molekularen Mechanismen der Re-Induktion weitgehend unbekannt, und Forschung ist im Gange in mehreren Laboratorien auf bestimmte modulierenden Faktoren von Astrozyten sezerniert wird, die eine optimale endothelialen Zelldifferenzierung 53,54 fördern könnten. Faktoren, die von Endothelzellen des Gehirns einschließlich Leukämie inhibierenden Faktor (LIF) sezerniert wurde gezeigt, dass Astrozyten 55,56 Differenzierung zu induzieren. Bevor Co-Kultur-Gründung, wurden Astrozyten, die Differenzierung Medium, das die Glucocorticoid-Rezeptor-Agonist Hydrocortison ausgesetzt und Co-Kultur-konditionierten Medium. Hydrocortison ist bekannt, dass die Dichtheit der Endothelzellen des Gehirns zu verbessern und wird in BBB-Modelle vor allem aus Ratte und Maus 57 58,59 endothelialen Zellen verwendet. Das konditionierte mediUm ist von der unteren Kammer der Endothelzelle / Astrozyten Co-Kultursystem nach 3 Tagen gesammelt und zur späteren Verwendung eingefroren. Der Einsatz von Co-Kultur-konditionierten Mediums reduziert die Zeit der endotheliale Zelldifferenzierung zu 3 Tage mit optimalen parazellulären Permeabilität für 2 Tage und auch eine verbesserte Reproduzierbarkeit zwischen den Kulturen.
Insgesamt ist das Protokoll beschreiben wir ergibt eine reproduzierbare TEER über 300 Ohm · cm 2 und eine durchschnittliche parazellulären Permeabilität Koeffizienten Pe (LY) von 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min, ähnlich zu den besten Primärzellbasis BBB Modelle 22, 12. Das Protokoll wird beschrieben in der vorliegenden Manuskript mit dem vorgeschlagenen Modulation von Mikrogefäß enzymatische Verdauung kann erweitert werden, um Zellen aus Rattenrückenmark 60 und von Mäusen Hirnendothelzellen.
Molekulare und funktionelle Charakterisierung
AußerdemTJ Induktion, Astrozyten auch zur Expression von Effluxtransporter wie P-gp in Hirnendothelzellen 61 beitragen. Wir zeigen in der Tat Ausdruck der Effluxtransporter P-gp in der BBB-Modell und wir zeigen die Polarität der P-gp Effluxpumpe Lokalisierung mit biochemischen Methoden und P-gp-Aktivität unter Verwendung eines funktionellen Assays. GLT-1-Expression wurde in den basalen Membranfraktion von Mikrogefäßen festgestellt, jedoch nicht in kultivierten RBEC detektiert. Wir vermuten, dass GLT-1 wurde in unserer RBEC Kultur im Vergleich zu in vivo-Bedingungen und damit nicht durch Western-Blot-Analyse nachweisbar geregelt. Überschüssige Glutamat neurotoxisch und in vivo ist GLT-1 gegen Glutamat-Efflux aus den basalen Fach (Parenchym) zu der apikalen Kammer (Durchblutung) verantwortlich. In Astrozytenkulturen bleibt GLT-1-Expression sehr gering und wird durch Zugabe von Glutamat im Medium 62,63 induziert.
Wir conf auchirm der Ausdruck der Zustrom Transporter an der apikalen Membran, wie LRP1, LDLR und TfR. Die Funktionalität der TfR und LDLR wurde mit Bindung und Transportexperimente von Tf-Cy3 und DiLDL von der luminalen auf die abluminalen Seite der Monoschicht wie zuvor mit einem Rind in vitro BBB Modell 64 gezeigt demonstriert. Interessanterweise wurde gezeigt, dass die Lipid Anforderung von Astrozyten erhöht die Expression von LDL-Rezeptor auf Endothelzellen Hirn 65,66 weitere Bestätigung der physiologischen Sprechen zwischen Astrozyten und Endothelzellen des Gehirns, einschließlich in vitro. Wir haben uns entschieden, Transport mit Fluoreszenzfarbstoffen wie veranschau wie Cy3 und Dil bedenkt, dass spektrofluorimetrischen Analyse ist in den meisten Labors zur Verfügung, und kann sich als nützlich erweisen, um in vitro BBB-Modelle zu validieren. Quantifizierung der Fluoreszenz ist jedoch weit weniger empfindlich als die Radioaktivität und erfordert eine Erhöhung der Anzahl von Experimenten, um signifikante Daten zu erhalten.Idealerweise Tf und LDL sind in der Regel radioaktiv markierten (Jod-125) für eine solche Bindung / Aufnahme und den Transport Experimenten.
Wir zeigen auch, dass die differenzierte Endothelzellen Monoschicht mit der vorgeschlagenen Protokoll erhalten reagiert auf Entzündungen, die durch TNF-α induziert, wie von CCL2 Mitteilung und BBB Öffnung enthüllt. CCL2 (MCP-1) und seinem Rezeptor CCR2 in ZNS-Erkrankungen wie Multiple Sklerose, experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE) 67, ZNS-Trauma und 68 werden als Mediatoren der Leukozyten-Migration in das ZNS unter Bedingungen neuroinflammatorische 69,70 bekannt beteiligt. Mit dem Protokoll getestet, können wir nicht feststellen, auf einer polarisierten Sekretion von CCL2 weil BBB-Öffnung ermöglicht die CCL2-Konzentration zwischen den beiden oberen (apikal) und unteren (basal) Fächer ausgleichen lassen. Folglich wir deutlich unterschätzt die Menge des durch die CCL2 RBEC im apikalen Kammer bei 24 Stunden (5A) hergestellt.
<p class="jove_content"> Gesamtübersicht und Grenzen der In-vitro-Modelle BBB: I n Vivo gegenüber In-vitro-und Nager gegen Menschen VergleicheViel versprechende ZNS-Medikamente, die wirksam bei der BBB-Passage in vitro nachgewiesen scheiterte in klinischen Studien wegen fehlender Vorhersehbarkeit von in-vitro-Modelle BBB oft auf Zellen anderer Spezies als Mensch isoliert basiert. Nach bestem Wissen unseren Erkenntnissen sind die in-vitro-Modelle BBB wahrscheinlich mehr Vorhersage, wenn es um das Studium mechanistische Aspekte von Protein-Netzwerken, Signaltransduktion, Transporter und Rezeptoren kommt. Jeder Mechanismus, Weg oder das Ziel in vitro untersucht werden muss, um seine Regulierung durch komplementäre Umweltreize (andere Zelltypen, Chemikalien, Proteine) mit der gleichen Tierspezies ist und in-situ-Untersuchungen kombiniert werdenUnd, wenn möglich, mit Mikrogefäßen und Endothelzellen aus Menschen isoliert, mit den Einschränkungen und Vorsicht hervorgerufen unten.
In-vitro-BBB-Modelle müssen als autonome Systeme, Regelung von Körper isoliert gesehen werden kann, aber immer noch mit großen in-vivo-Eigenschaften und das Potenzial für Regulierung durch Umweltreize dotiert. Kein "ideales" in vitro BBB Modell wurde noch vorgeschlagen 71,72,73 weil die endotheliale Zellmonoschichten fehlen einige wichtige Bestandteile des Neuro Glia Gefäßeinheit (NGVU) und von Blut und Körperregulierung isoliert. Das Fehlen von Perizyten 74,16 oder 17,18 Neuronen oder die verschiedenen Bestandteile der extrazellulären Matrix für die Kunststoffbeschichtung oder dem Kulturmedium und das Serum für das Zellwachstum in den häufigsten und "einfachste gemacht" in vitro BBB Modelle basierend auf Endothelzellen verwendet Zellen mit Astrozyten differenziert kann die Proteinexpression i modulierenn Vergleich mit der in vivo Situation 75. Diese Modelle können viele Transporter in vivo angezeigt zu äußern, aber nicht alle. In einigen Fällen wurden die ersten Transportparameter in isolierten Mikrogefäßen (am nächsten zu der in vivo-Situation) überprüft, und studierte dann in Zellkultursystemen 76,61.
Molekularbiologischen Forschung hat es der Charakterisierung von Gen-und Proteinexpression in isolierten Mikrogefäßen und niedrigen Gang Endothelzellkulturen aus der gleichen Art, und zwischen den verschiedenen Arten, meist aus Kleintiere wie Nagetiere (Mäuse und Ratten) oder vom Rind und Schwein Vergleich zu Menschen 77,78,75,15. Transkriptomischen Vergleich zwischen in vivo-und in vitro-Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen zeigten zahlreiche Gentranskripten, die differentiell exprimiert wurden und die am häufigsten in vitro signifikant herunterreguliert. Transcripts Zustrom Transportern wie TfR und pr Codierungoteins in Vesikeltransport beteiligt sind vor allem in kultivierten Endothelzellen des Gehirns herunterreguliert, was auf eine allgemeine Abnahme der Endozytose und Vesikeltransport in solchen Zellen. Kultur Manipulation in Bezug auf Reinheit (Puromycin-Behandlung) und die Behandlung mit Hydrocortison kann dazu beitragen, ein "in-vivo-ähnlichen" Genexpressionsprofil 77 wiederherzustellen. Transkriptom-Studien ergaben auch wichtige Unterschiede zwischen Arten, die weiter erschweren Prognosen auf Arzneimittelaufnahme bei Menschen auf der Grundlage Nagetier in vitro BBB-Modelle 75. In-vitro-Modelle, die BBB-Co-Kultur von humanen Endothelzellen und Astrozyten wurden 15 beschrieben. Obwohl relevant sind diese Modelle schwieriger zu implementieren regelmäßig, wie sie dass geregelte Zugang zur postmortalen menschlichen Gewebe und es gibt Heterogenität der Qualität / Eigenschaften der menschlichen Gehirn-Endothelzellen, je nach Alter, Krankheiten und möglicherweise medizinische treatment von Spendern. Anstrengungen unternommen, um neue in-vitro-Modellen, die eine bessere Reproduktion der physiologischen, anatomischen und funktionellen Eigenschaften der in vivo BBB entwickeln. Co-Kulturen, die drei-Zelltypen sind sehr restriktiv und schwierig erscheint, routinemäßig zu implementieren. Bis heute sind die komplexesten in vitro BBB-Modelle sind die dynamischen in-vitro-Modelle (DIV-BBB), die gefäßartige Organisation mit Astrozyten gehören und beinhalten eine Strömung von Medium, das den Blutfluss 75,79,80,81,82 nachahmt, 83,84,85. Wenn zerebralen Endothelzellen zu einer Strom ausgesetzt ist, aktiviert die erzeugte Scherspannung mechanotransducers an der Zelloberfläche, die die Expression verschiedener Gene in Endothelzellen Physiologie wie Zellteilung, Differenzierung, Migration und Apoptose beteiligt 80 zu modulieren. In vivo Scherbeanspruchung durch den Blutstrom erzeugt wird, ist für mitotische Festnahme an der Zellkontakt, der die Einrichtung ermöglicht ein verantwortungsendothelialen Zellschicht der Blutgefäße 80. Genom-und Proteom-Analyse des normalen menschlichen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen zeigte die Auswirkungen der Schubspannung in Endothelzellen BBB Physiologie 84. Scherbeanspruchung ist für das Überleben der Zelle, einen höheren Grad der endothelialen Zelladhäsion, Effluxpumpe Induktion und bessere Polarisation Transporter 75, der Regulierung des Glukosestoffwechsel 75,86, Oxidation durch CYP450 Enzyme 75 und die Regulierung der parazelluläre Permeabilität durch Erhöhung der Expression von Genen, die für die interzelluläre junctional Elemente wie Occludin und ZO-1 87,75,80 und damit hohe TEER rund 1.500 – 2.000 Ohm · cm 2, in der Nähe von in vivo bekannten Parameter 79,80
In der Biotechnologie-und Pharmaindustrie, Routine-Screening von Drogen oder sogar Hochdurchsatz-Screening (HTS) und die Bemühungen um Tierversuche zu reduzieren, führtefür die Entwicklung der verschiedenen Zelllinien in Ersatz der Primärkultur von zerebralen Endothelzellen, die schwieriger zu routineAufbau verbleiben verwendet werden. In den meisten Fällen wurden Primärkulturen von zerebralen Endothelzellen mit einer immortalisierenden Gen (SV40 oder Polyoma large T-Antigen und Adenovirus-E1A) entweder durch Transfektion von Plasmid-DNA oder durch eine Infektion mit retroviralen Vektoren transduziert 88,89,75,. Mehrere endothelialen Zelllinien von zerebralen Ursprungs wie die RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBs oder rBCEC4 Rattenzelllinien 88,75, der b.End3 Mauszelllinie 90,75, die PBMEC/C1 entwickelt – 2 Schweine-Zelllinie 87,75, und die hCMEC/D3 menschlichen Zelllinie 89,75. Andere Modelle, die sich auf Zellen des nicht-zerebralen Ursprungs wie der Madin-Darby-Hundenieren (MDCK)-Zelllinien oder Caco2 12,75 berechnet. Unter den verschiedenen menschlichen Groß endothelialen Zelllinien hat das hCMEC/D3 weit zitieren wordend verbessert und als ein Modell der BBB seit seiner Gründung im Jahr 2005 91,92. Wie bei Primärkulturen, Zelllinien vorhanden Vorteile und Grenzen. Sie sind leichter zu handhaben als Primärkulturen haben eine erweiterte Lebensdauer, sind gut gekennzeichnet und lassen Reproduzierbarkeit zwischen Großversuche. Allerdings können Zelllinien, Gewebe-spezifische Funktionen verlieren, verlieren Umweltregulierung und erwerben ein Molekular Phänotyp ganz andere Zellen in vivo 75, 89. Insbesondere Monoschichten aus Zelllinien vorhanden Dichtheit reduziert, niedrige TEER und Show-Transporter Profilvariation 75,89 erzeugt. Somit Tierversuchen oder Studien in Primärzellen sind oft trotz ihrer zusätzlichen Komplexität bevorzugt.
The authors have nothing to disclose.
Finanzielle Unterstützung für VECT-HORUS wird aus dem Fonds Einzigartige Interministériel (FUI / MEDUL Projekt) und VECT-HORUS und dem UMR7259 Labor von der Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC und PREVENTAD Verbundprojekte) anerkannt . Die UMR7259 Labor bestätigt auch finanzielle Unterstützung von der CNRS und von Aix-Marseille Université.
Product | Company | Catalog Number | Comments / expiration term |
BSA fraction V low endotoxin | PAA | K45-011-500g | 4 °C |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | - 20 °C |
0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Invitrogen | 25300-054 | - 20 °C |
DMEM High Glucose | Invitrogen | 61965-026 | 4 °C |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10270-098 | - 20 °C / 1 year |
T75 flasks | Becton Dickinson Falcon | 353135 | |
HEPES buffer (1 M) | Invitrogen | 15630-056 | 4 °C / 1 year |
Collagene type IV mouse (10 x 1 mg) | Becton Dickinson | 356233 | - 20 °C / 1 month |
Fibronectin humain plasma (5 mg) | Becton Dickinson | 356008 | - 20 °C / 1 month |
Vannas Spring Scissors, straight (9 cm) | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Scissors, straight (9 cm) | Fine Science Tools | 14568-09 | |
Forceps Dumont #5/45 (11 cm) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
Graefe Forceps, tip width 0,8 mm | Fine Science Tools | 11050-10 | |
Graefe Forceps, curve tip width 0,8 mm | Fine Science Tools | 11051-10 | |
Collagenases / Dispase mix (2 x 5 mg) | Roche Diagnostics | 05 401 054 001 | – 20 °C / 3 months |
DNase I (100 mg / 569 KU / mg) | Sigma Aldrich | DN25-100 mg | - 20 °C / 1 year |
Gentamicin (10 mg/mL) | Invitrogen | 15710-049 | 4 °C / 1 year |
DMEM/F12 | Invitrogen | 31331-028 | 4 °C |
Bovine serum from platelet poor plasma (500 mL) | Clinisciences | BT-214-100 | - 20 °C / 1 year |
bFGF (10 µg) | Invitrogen | 13256-029 | - 20 °C / 6 months |
Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I | Sigma Aldrich | H3149-100KU | 4 °C / 1 year |
Puromycin | Sigma Aldrich | P8833-10 mg | - 20 °C / 6 months |
ITSX | Invitrogen | 51500-056 | 4 °C / 1 year |
Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates | Millipore | PIRP15R48 | Porosity: 1 µm Surface: 1,1 cm2 |
Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888-1 g | - 20 °C / 1 year |
Mouse anti-CD31 / PECAM | Chemicon | MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL) | 1/200 – fixation PFA 4% |
Rabbit anti-Von Willebrand | Chemicon | AB7356 | 1/200 – fixation PFA 4% |
Mouse anti-Desmine | Chemicon | MAB3430 | 1/200 – fixation PFA 4% |
Mouse anti-Vimentine | Invitrogen, Zymed | 08-0052 clone V9, (58 µg/mL) | 1/50 – fixation PFA 4% |
Mouse anti-Claudin-5 | Invitrogen, Zymed | 35-2500, (500 µg/mL) | 1/200 – fixation PFA 4% |
Rabbit anti-ZO-1 | Invitrogen, Zymed | 61-7300 (250 µg/mL) | 1/200 – fixation PFA 4% |
Rabbit anti-Occludine | Invitrogen, Zymed | 71-1500 (250 µg/mL) | 1/200 – fixation PFA 4% |
Alexa fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies | Invitrogen | 1/800 | |
Lucifer yellow CH, dilithium salt | Sigma Aldrich | L0259 | - 20 °C |
TNF-a Human | PeproTech | 300-01A | - 20 °C |
Rat MCP-1 ELISA Kit | PeproTech | 900-K59 | 4 °C / – 20 °C |
Mouse anti-P-glycoprotein | Covance, Eurogentec | SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL) | 1/400 – fixation PFA 4% 1/200 (western blot) |
Rabbit anti-GLT-1 | Abcam | ab41621 | 1/1000 (western blot) |
Rhodamine 123 | Sigma Aldrich | 83702 | 4 °C |
Verapamil hydrochloride | Sigma Aldrich | V4629 | 4 °C |
Cyclosporine A | Sigma Aldrich | 30024 | 4 °C |
Monoclonal anti a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat | American Diagnostica | 3501 (100 µg/mL) | 1/5 – fixation PFA 4% |
Mouse anti-LDLR | R&D systems | AF2255 (200 µg/mL) | 1/50 – fixation PFA 4% |
Rat transferrin-Cy3 | Gentaur | JOR160050 | 4 °C |
DiILDL | Invitrogen | L-3482 | 4 °C |