Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli<em> C. elegans</em

1.. C. elegans Büyüme Standart yetiştirme yöntemleri 1 olarak başına OP50 bakteri ile ekim 35 mm Nematod Büyüme Medya (NGM) agar plakaları, hazırlayın. Bir numaralı seribaşı NGM tabağa 6 gravid yetişkin koyarak C. elegans senkronize. ~ 100 yumurta (~ 3 saat) atılmıştır sonra yetişkin çıkarın. Solucanlar, genç yetişkin aşamaya geliştirilmiş ve bu deney için en uygun olacak olan ve bu noktada 20 ° C'de 3 gün boyunca inkübe edilir. C senkronize etmek için alternatif protokoller elegans başka bir yerde, 10 tarif edilmiştir. 2. AS için malzemeler M9 tamponu (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na 2 HPO 4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO 4) N2 ile dengelenmeleri oksijenden arındırılmış olmalıdır önceki deneyden 30 dakika boyunca (argon da kullanılabilir) ve buz ile çevrili tuttu. Küçük bir delik (3 mm olun) genişliğinde 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri kapağı hangi solucanlar AS boyunca yerleştirilecektir. Bu aşırı medya buharlaşma yol açabilir gibi delik, kapağı açık tutmak olmadan gaz değişimi sağlar. 3. Anoksi / Açlık En az üç nüsha halinde tüm deneyler. Yukarıda tarif edildiği gibi büyütüldü genç yetişkin solucanlar içeren her bir 35 mm plaka, oda sıcaklığında 1 ml, oksijenli M9 tampon ekleyin. (Bakteri numaralı seribaşı değil kenarlarına M9 ekleyin) plaka bakterilerin uzaklaştırılması önlemek için dikkatli olun. ~ 1 dakika sonra solucanlar M9 yüzme edilmelidir. Pipetle steril bir% 1 BSA çözeltisi ile ihraç Coat BSA ile, 1 ml pipet. Dikkatle M9 tampon solucanları içeren plaka eğim, eklendiği aynı yerden M9 kaldırmak ve hazırlanan mikrosantrifüj tüpler süspansiyon yerleştirin. Solucanlar tüplerin altına düştü kadar buz içinde kalan olsun (~ 1-2 Dk). (Yaklaşık 100 ul bırakarak) tüpten solucanları bozmadan M9 mümkün olan en fazla miktarda çıkarın, oksijen-temizlendi ve buzlu M9 1 ml ekleyin ve solucanlar yeniden dibe kadar buz üzerinde tüp yerleştirin. Son adım 3x tekrarlayın. ~ 100 ul tüp içinde kalıncaya kadar, son yıkama olarak, M9 çıkarın. (Bölüm 3.6.2, aşağıdaki talimatlara bakın) özel bir kapalı kap içine, alternatif, (aşağıdaki talimatları, Bölüm 3.6.1) veya bir anoksik / hipoksik odasının içine deoksijene M9 solucanlar ile tüpler yerleştirin. Ticari bir anoksik / hipoksik odası kullanılacak ise, adım 3.5 başlamadan önce odasının içinde bazı tasfiye M9 bırakın ve solucanlar odasının içine bir kez adımı 3.5 tekrarlayın. Özel bir bölme kullanılacak ise, düşük maliyetli bir cihaz oluşturmak için ne kadar ayrıntılı bir açıklaması, bu protokol sonunda yer almaktadır ve daha önce 11 başka bir grup tarafından tarif edilmiştir. Kısaca: <ol> 250 ml Tupperware-tipi konteynır kapağının iki delik yapmak ve onlara tüp konnektörleri ekleyin. Bir diğer bir su banyosu içine gaz çıkış olacak ise gaz karışımı enjekte etmek için kullanılacaktır. Bölmenin içine solucanlar yerleştirin ve kapağı ile sızdırmaz odayı. Sabit bir N2 akışı (100 ml / dakika) ile gaz. 26 ° C'de bir su banyosu içinde kap yerleştirin Herhangi bir sızıntı (bölmenin kendisinden kaynaklanan kabarcıkları ile görünen) sistemde olduğu ve hava geri döner, böylece çıkış tüpü de suya batırılır olduğundan emin olun. 20 saat boyunca 26 ° C'de inkübe solucanlar. 4. Simüle Reperfüzyon Gibi koşullar altında, 20 saat sonra oda havası içine inkübasyon odasından tüpleri çıkarın. Pipet C. Bir OP50 üzerine (adım 3.3 gibi) bir BSA kaplı ucu ile elegans 35 mm NGM plaka numaralı seribaşı. 24 saat boyunca 20 ° C'de inkübe edin.Bundan sonra, solucanlar atılır hazır olacaktır. 5. Canlı Worms Karşı Ölü belirlenmesi Bir platin almak kullanarak, hafifçe solucanın başının üst dokunun. Canlı solucanlar dokundu sonra geriye doğru hareket edecek. Solucanlar vermeyen iseniz, ölü olarak puan. Bazen, bir solucan geriye hareket değil, ama hafif bir yan-yan kafa hareketi görülebilir. Teknik ölü olmasa da, bu solucanlar saat içinde sona erecek neredeyse kesin, ve ölü olarak atılır gerekir. Bir solucan puan için çok uzun beklerse, döl iç çıkım oluşabilir ve bu "çanta-of-solucan" çok zor leşleri tespit yaparak, yırtılabilir. Onlar yinelenen sayar önlemek için sayılır gibi plakadan hem de canlı ve ölü solucanları kaldırmak. Canlı solucanlar davranış testleri gerçekleştirmek için ayrı bir plaka taşınmış olabilir. Toplamına göre, canlı solucan miktarı kalan solucanların% 'si olarak ifade edilir (Şekil 1A </stRong>). 6. Tepki Testi dokunun Bu protokol ayrıntılı bir açıklama Hart, Anne C., ed sunulmuştur. Davranış (3 Temmuz 2006), WormBook, ed. C. elegans Araştırma Topluluğu, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. Dokunmatik yanıt için puan için, hareketli ve hafif bir kirpik çekme (Şekil 3) ile (yutak orta kısmına yakın) solucan başının tarafına dokunmayın vardır solucanları tespit. Solucan geri hareket ederse, gibi duyarlı puan, değilse, (Şekil 1B) olarak vermeyen puan. 10 saniye aralıklarla her solucan için bu adım 10-15x tekrarlayın. Doğru veriler olması için her gruptan en az 10 solucanlar inceleyin. Aynı deney, arka gövde duvarına hafif dokunma, aşağıdaki ileri ettirici değişiklikleri değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu ayrı bir davranışı uyarır, çünkü solucanın baş veya kuyruk dokunmak için değil emin olun. Son olarak, inkurumsal genetik kontrol suşları [negatif pozitif, mec (mechanosensory) mutant için N2 Bristol vahşi-tip – örneğin CB1338 mec-3 (e1338) IV] solucanlar dokunmak ile kuvvet kalibre etmek. Bir uyarım çok sert çok az vahşi tip N2 kontrollerde bir etki ortaya olmaz, mec mutantlar davranışsal bir tepki ortaya çıkarır. 7. Nöronal Değişiklikler , Nöronal değişiklikler AS yazı görselleştirmek dokunmatik yanıt mec nöronlar 4,5 GFP ifade bir yük kullanın. Bu nöronlar vücut duvarı boyunca uzanan ve kolayca morfolojik anormallikler için atacak uzun süreçleri var. Buna ek olarak, morfolojik bilgileri yukarıda tarif edildiği gibi, nöronal fonksiyon davranışsal önlemler ile entegre edilebilir. Bu amaçla kullanılabilecek bir suş C ile kullanılabilir TU2583 olduğu elegans Genetik Center ileri ve geri GFP ifade uIs25 entegre transgen içerirentegre bir mec-3 :: GFP füzyon içeren MEC-18 promotör, ya da seçenek olarak TU2562, m. Bir agaroz dolgusunu hazırlayın. Su içinde, bir 10x stok ile M9 1x getirmek, ve 70 ° C de muhafaza solüsyonu% 2 agaroz eritilir Kendi alt tarafında bant tek parça, her biri iki slaytlar arasında yerleştirilmiş olan bir cam slayt (75 mm x 25 mm) bu çözeltinin, bir damla (~ 20 ul) yerleştirin. % 2 agaroz çözeltisi üzerine ilk dik olan bir nihai cam slayt yerleştirin ve oda sıcaklığında soğumaya bırakın. Bu, bant kalınlığı olan bir pedi oluşturmalıdır. Üst slayt kaldırmak ve solucanlar hareketsiz olacaktır% 0.1 Tetramisole içeren M9 10 ul ekleyin. % 2 agaroz slayt üzerine solucanları yaşayan bazı (~ 10) hareket ettirin. Üzerlerine bir lamel yerleştirin ve uygun aydınlatma ile bir 100X objektif altında bir floresan mikroskop kullanılarak GFP görselleştirmek. Hasarlınöronlar işlemler (Şekil 2B) kırılabilir görünür bir sitosolik zar çok punktum (Şekil 2A) oluşan işlemlerinde inci Desenin dize ve / veya anormallikleri gösterir. En az 10 solucanlar toplam kullanarak, her bir solucan için hem nöronlarda punktum ve anormallikleri saymak. 8. Lab yapımı Hipoksik Odası Bir Tupperware tarzı, yapışmalı, hava geçirmez kap bir oksijensiz odası olarak güçlendirme edilebilir. Mümkün olduğu kadar küçük bir kap seçmek için özen gösterin. Küçük bir kap daha hızlı hipoksik ortam yaratır ve (Şekil 4) su banyosu içinde uyacak şekilde daha kolaydır. Kapak üzerinde iki delik (bir tornavida ile ya da forseps ısıtma ve kapağının içine zorlayarak yapılabilir) yapmak ve tüp (Şekil 5A) uygun bir plastik veya metal konnektörü takın. Su altında yerleştirilebilir tutkal kullanın ve aynı zamanda hareket kaçınarak, kuruduktan sonra zorlaşıyorbağlayıcı ve dolayısıyla sızıntı olasılığını (Şekil 5B) azaltır. (Şekil 4) tamamen daldırılmış, böylece kap su banyosu içine yerleştirilmelidir. Kabı batırmak için, bir şişe ağırlık veya bir dalış ağırlık kullanın. Boru bağlantılarının biri bir gaz karışımı tanıtmak ve diğer boru, kap dış çevre (Şekil 4) karşı sızdırmazlığı temin edilir, böylece bu nedenle su altında bırakılmalıdır, bir basınç kabartma olarak hareket edecek kullanılacaktır. Hava bileşim özel yapılmış gaz, kütle akış kontrol ya da gaz karışımları arzu edilen herhangi bir aparat kullanılarak modüle edilebilir. Yüksek akış aşırı buharlaşma oluşturabilir olarak gaz akışı, kontrol edilmelidir. Örneğin, bir 250 ml kap içinde, gaz 100 ml / dakika solucanlar için iyi bir alan ve uygun bir akışı sağlayacaktır. Bunlar gaz, a karşı geçirgen olabilir olarak boru uzunluğu, en az tutulmalıdırllowing O 2 giriş. Bu malzemeler gaz alışverişine geçirgen olduğu gibi silikon kullanmaktan kaçınmak önemlidir, Tygon borular. Biz polipropilen ya da naylon tüpler tercih. Cam ya da metal boru de gazlar muhafaza, aynı zamanda çalışmak zordur.