Um modelo de anóxia-inanição por isquemia / reperfusão em<em> C. elegans</em

1. C. Crescimento elegans Prepare 35 milímetros Nematode Crescimento Mídia (NGM) placas de ágar semeado com OP50 bactérias, como por métodos de cultivo padrão 1. Sincronizar C. elegans, colocando 6 adultos grávidas em uma placa NGM semeado. Retire os adultos após ~ 100 ovos foram estabelecidas (~ hr 3). Incubar as placas durante 3 dias a 20 ° C, altura em que os vermes desenvolveram a fase adulta jovem e são ideais para este experimento. Protocolos alternativos para sincronizar C. elegans são descritos em outro lugar 10. 2. Materiais para AS Tampão M9 (22 mM de KH 2 PO 4, 42 mM de Na 2 HPO 4, 86 mM de NaCl, 1 mM de MgSO4) deve ser purgado de oxigénio foram equilibradas com N 2 (árgon pode também ser usado), durante 30 minutos antes da experiência e mantido rodeado de gelo. Faça um pequeno furo (3 mmde largura) na tampa de 1,5 ml em tubos de microcentrífuga que os vermes serão colocados durante AS. O buraco permite a troca gasosa sem manter a tampa aberta, pois isso pode levar à evaporação excessiva da mídia. 3. Anóxia / Fome Realizar todas as experiências pelo menos em triplicado. Adicionar 1 ml de tampão M9 RT, oxigenado para cada placa de 35 milímetros contendo vermes adultos jovens cultivadas como descrito acima. Tenha cuidado para evitar a remoção de bactérias da placa (adicionar M9 para as bordas onde as bactérias não foram semeadas). Após cerca de 1 min os vermes deve estar nadando no M9. Brasão uma ponta de pipeta de 1 ml com BSA por pipetagem e expulsando um estéril solução BSA 1%. Incline cuidadosamente a placa contendo os vermes em tampão M9, retire a M9 do mesmo lugar onde foi adicionado, e colocar a suspensão nos microtubos preparados. Deixar em repouso em gelo até que os vermes têm caído para a parte inferior dos tubos (~ 1-2 Minutos). Retire a quantidade máxima de M9 possível, sem perturbar os vermes do tubo (deixando cerca de 100 mL), adicionar 1 ml da M9 e gelado purgado em oxigênio e colocar o tubo sobre o gelo até que os vermes se depositam no fundo de novo. Repita o último passo de 3x. Na última lavagem, remover o M9 até ~ 100 ul permanece no tubo. Coloque os tubos com os vermes em desoxigenado M9 dentro de uma câmara anóxica / hipóxica (veja as instruções abaixo, Seção 3.6.1) ou, alternativamente, em um recipiente personalizado selado (veja as instruções abaixo, Seção 3.6.2). Se um anóxico / hipóxico câmara comercial é para ser usado, deixe alguns M9 purgado dentro da câmara antes de iniciar o passo 3.5 e repita o passo 3.5, uma vez que os vermes estão dentro da câmara. Se uma câmara personalizado está a ser utilizado, uma descrição detalhada de como criar um aparelho de baixo custo é apresentado no final de este protocolo e foi descrito por outro grupo anteriormente 11. Resumidamente: <ol> Faça dois furos em uma tampa de 250 ml Tupperware-tipo de recipiente e adicione conectores do tubo para eles. Um vai ser utilizado para injectar a mistura de gás, enquanto o outro será a saída de gás para dentro de um banho de água. Colocar os vermes para a câmara e da câmara de vedação com a tampa. Gás com um constante fluxo de N2 (100 ml / min). Colocar o recipiente dentro de um banho de água a 26 ° C. Certifique-se de que o tubo de saída é bem imerso em água de modo nenhum retorno de ar e que não há fugas no sistema (aparente por bolhas decorrentes da câmara em si). Incubar os vermes, a 26 ° C durante 20 hr. 4. A reperfusão Simulado Depois de 20 horas, sob condições, retire os tubos da câmara de incubação em ar ambiente. Pipeta C. elegans com uma ponta BSA-revestido (como no passo 3.3) para um OP50 semeado 35 milímetros placa NGM. Incubar as placas a 20 ° C durante 24 hr.Depois disso, os vermes estará pronto para ser marcado. 5. Identificar Morto Versus vivo Worms Usando uma picareta platina, tocar levemente a parte superior da cabeça do verme. Vermes vivos irá se mover para trás depois de ser tocado. Se os vermes estão sem resposta, marcar como morto. Ocasionalmente, um verme não irá se mover para trás, mas podem apresentar um leve movimento de cabeça de lado a lado. Apesar de não ser tecnicamente morto, esses vermes são quase certo para expirar em questão de horas, e deve ser marcado como morto. Se alguém espera muito tempo para marcar os vermes, choque interno de progênie pode ocorrer e esses "sacos-de-vermes" podem se romper, fazendo detectar as carcaças muito difícil. Remova ambos os vermes vivos e mortos da placa como eles são contados para evitar contagens duplicadas. Os vermes vivos pode ser transferida para uma placa separada para realizar ensaios comportamentais. A quantidade de vermes que vivem em relação ao total é representada como a% de vermes sobreviventes (Figura 1A </strong>). 6. Toque Ensaio de Resposta Uma descrição detalhada deste protocolo tem sido apresentada em Hart, Anne C., ed. Comportamento (3 de Julho de 2006) WormBook, ed. O C. elegans investigação comunitária, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. Para marcar a resposta ao toque, identificar vermes que estão se movendo e tocar levemente a lateral da cabeça do verme (perto da parte central da faringe) com um picador de cílios (Figura 3). Se o worm se move para trás, a pontuação tão sensível, se não, marcar sem resposta (Figura 1B). Repita este passo 10-15x para cada verme com intervalos de 10 segundos. Sonda pelo menos 10 vermes em cada grupo para ter dados precisos. O mesmo ensaio pode ser usado para avaliar a frente alterações locomotory seguinte toque de luz para a parede do corpo posterior. Cuidado para não tocar na cabeça ou cauda do verme, pois isso estimula um comportamento distinto. Finalmente, emestirpes de controlo genético corporativos [N2 Bristol tipo selvagem para, mec (mecanosensorial) mutante positiva para negativa – por exemplo CB1338 mec-3 (e1338) IV] para calibrar a força com que tocar os vermes. Muito dura de estimulação vai provocar uma resposta comportamental em mutantes mec, muito pouco não vai provocar um efeito em controles de tipo selvagem N2. 7. Neuronal Modificações Para visualizar pós AS modificações neuronais, use uma estirpe que expressa GFP no MEC neurônios respondendo toque 4,5. Esses neurônios têm processos longos que correm ao longo da parede do corpo e são facilmente marcados por alterações morfológicas. Além disso, a informação morfológico pode ser integrado com medidas comportamentais da função neuronal, como descrito acima. Uma estirpe, que pode ser usada para esta finalidade é TU2583, que está disponível a partir da C. elegans Genetics Center e contém o transgene integrado uIs25 expressando GFP frosou o mec-18 promotor, ou, alternativamente, TU2562, que contém um mec-3 :: GFP fusão integrado. Prepare uma almofada de agarose. Derreter 2% de agarose em água, para trazer 1x M9 com um estoque de 10x, e manter a solução a 70 ° C. Colocar uma gota (~ 20 ul) desta solução numa lâmina de vidro (25 mm x 75 mm) que foi colocada entre duas outras lâminas, cada um dos quais com um único pedaço de fita adesiva sobre o seu lado inferior. Coloque uma lâmina de vidro final, perpendicular ao primeiro na parte superior da solução de agarose a 2%, e deixá-la arrefecer à temperatura ambiente. Isto deve formar uma almofada que é a espessura da fita. Retire o topo de slides e adicione 10 ml de M9 contendo 0,1% de tetramisol, que imobilizam os vermes. Mova alguns (~ 10) viver vermes na agarose slides 2%. Coloque uma lamela sobre eles e visualizar GFP utilizando um microscópio de fluorescência sob um objetivo 100X com a iluminação adequada. Estragadoneurónios irá mostrar uma cadeia citosólica membrana de padrão de pérolas nos processos, composta de punctum múltipla (Figura 2A), e / ou anomalias em que os processos parecem ser quebrada (Figura 2B). Contagem de punctum e anomalias em ambos os neurónios de cada verme, usando um total de pelo menos 10 vermes. 8. Fez-Lab Hipóxica Câmara A Tupperware estilo, recipiente lacrado, hermético pode ser retrofit como uma câmara anóxica. Tome o cuidado de selecionar um recipiente que é tão pequeno quanto possível. Um pequeno recipiente cria um ambiente hipóxico mais rápido e é mais fácil de se encaixar no banho de água (Figura 4). Fazer dois furos na tampa (pode ser feito com uma chave de parafusos ou por aquecimento de uma pinça e forçando para a tampa) e inserir um conector de plástico ou de metal que se encaixa no tubo (Figura 5A). Use cola que pode ser colocado debaixo de água, e também fica difícil após a secagem, evitando o movimento deo conector e, portanto, reduzindo a possibilidade de fugas (Figura 5B). O recipiente deve ser colocado no banho de água de modo que é completamente submersa (Figura 4). Para mergulhar o recipiente, use um peso garrafa ou um peso de mergulho. Um dos tubos de conexão vai ser usada para introduzir uma mistura de gás e o outro tubo irá actuar como um limitador de pressão, pelo que deve ser deixado sob a água de modo que o recipiente é selado a partir do ambiente externo (Figura 4). A composição do ar pode ser modulada por meio de gás feito à medida, controladores de fluxo de massa ou qualquer aparelho que mistura os gases desejados. O fluxo de gás deve ser controlado, como de alto fluxo pode criar uma evaporação excessiva. Por exemplo, em um recipiente de 250 ml, 100 ml / min de gás irá proporcionar boa espaço para os vermes e um fluxo adequado. O comprimento da tubagem deve ser mantida a um mínimo, dado que pode ser permeável a gás, umallowing a entrada de O 2. É importante evitar o uso de silicone, tubos Tygon vez que estes materiais são permeáveis ​​a troca de gás. Preferimos tubos de polipropileno ou nylon. Vidro ou tubos de metal manter os gases de bem, mas também são mais difíceis de se trabalhar.