对缺血/再灌注在缺氧，饥饿型号<em> C。线虫</em

1，C.线虫生长准备35毫米线虫生长培养基（NGM）接种OP50细菌的琼脂平板上，按标准种植方法1。 放置6妊娠成人到种子NGM板同步线虫 。取出后，大人〜100个卵已经奠定（〜3小时）。 孵育所述板3天在20℃时，在该点的蠕虫会发展到年轻成年阶段和最适合于该实验。另一种协议来同步C.线虫在其他地方10描述。 2。材料用于AS M9缓冲液（22 mM的KH 2 PO 4，42 mM的钠2 HPO 4，86 mM氯化钠，1mM的MgSO 4干燥），应通过与N 2平衡的氧气吹扫（氩气也可以被使用）在30分钟期间在实验前并保存在冰中。 做一个小孔（0.1毫米宽）在1.5ml的微量离心管的盖子，其中，蠕虫将被放置在AS中。孔允许气体交换不保持盖子打开，因为这可能会导致过多的介质蒸发。 3。缺氧/饥饿进行所有的实验至少一式三份。 加入1 ml的RT，含氧M9的缓冲区含有上述长大年轻的成虫超过35毫米的钢板。要小心，以避免板去除细菌（M9添加到细菌不接种的边缘）。经过约1分钟的蠕虫，应在游泳的M9。 大衣1毫升枪头，与BSA吹打和驱逐无菌的1％BSA溶液。 小心倾含在M9缓冲蠕虫的板，从那里它被加在同一个地方取出M9，然后将悬浮液中制备的微量离心管中。让我们休息，直到冰蠕虫已经下降到管的底部（〜1-2分）。 除去M9的可能的最大数量不脱离管干扰虫（留下约100微升），加入1毫升的氧气吹扫和冰镇的M9和将管在冰上，直到蠕虫沉淀到底部一次。重复最后一步3倍。在最后一次洗涤，除去M9直到〜100微升保留在管中。 放置的蠕虫在脱氧的M9缺氧/缺氧室内部的管子（见下面的说明，第3.6.1节），或者，到定制的密封容器中（见下面的说明，第3.6.2节）。 如果商业缺氧/缺氧室是被使用，留下一些吹扫M9室内部开始步骤3.5之前，重复步骤3.5一旦蠕虫是在腔室内部。 如果自定义室被使用，如何创建一个低成本的设备的详细说明，提出了在本协议的结束，已被描述的另一组先前11。简单地说： <ol> 使两孔在250毫升百惠型容器盖，并添加管连接到它们。一个将被用于将气体混合物注入，而另一个将是气体出口进入水浴。 将蠕虫进入腔室并用盖子密封所述腔室。 气体以恒定的氮气流（100毫升/分钟）。 放置在容器内的水浴在26℃。确保出口管以及浸入水中所以没有空气的回报，而没有泄漏的系统（由从腔室本身所产生的泡沫表观的）。 孵化虫在26℃下20小时。 4。模拟再灌注 AS条件下20小时后，取出从孵化室管进入室内空气。 C.移液器线虫用BSA包被的尖端（如在步骤3.3）安装到一个OP50接种35毫米NGM板。培养板在20℃下24小时。在此之后，蠕虫将准备进行评分。 5。确定死亡对战现场蠕虫使用铂挑，轻轻触摸蠕虫的头顶。现场蠕虫会被感动后向后移动。如果蠕虫是无反应，比分为死。偶尔，蜗杆不会向后移动，但是可能表现出轻微的一侧到另一侧头部的运动。虽然技术上不是死了，这些蠕虫几乎可以肯定，在几小时内到期，应评价为死。如果等待时间过长的得分蠕虫，后代的内部孵化可以发生，这些“包包 – 的蠕虫”可破溃，使检测的尸体很困难。 从板块中删除这两个活的和死虫，因为它们是计算以避免重复计数。活蠕虫可以移动到一个单独的板块进行行为分析。相对于总活虫量表示为幸存的蠕虫％（ 图1A </st荣>）。 6。触摸响应分析此协议的详细描述已经呈现在哈特，安妮三，编辑。行为（2006年7月3日），WormBook，编辑。该三线虫研究社区，WormBook，doi/10.1895/wormbook.1.87.1，http://www.wormbook.org。 进球的触摸响应，识别正在轻轻用睫毛挑（ 图3）摸虫的头部侧（靠近咽喉的中间部分）的蠕虫。 如果蠕虫向后移动，拿到尽可能响应，如果没有，得分为无反应（ 图1B）。用10秒的时间间隔重复此步骤，10-15X的每个虫。探测至少10蠕虫每组中有准确的数据。相同的测定可用于评估向前下列轻触摸到后主体壁运动器官的变化。请务必不要触摸蠕虫的头部或尾部，因为这会刺激一个独特的行为。 最后，在企业基因对照菌株[N2布里斯托尔野生型为阳性，MEC（mechanosensory）突变为负数- 例如 CB1338 MEC-3（e1338）IV]校准与触摸蠕虫的力量。过于苛刻的刺激会引起一个行为反应在MEC突变，过少会不会引起在野生型N2控制的效果。 7。神经修改以可视化的岗位作为神经修改，使用菌株表达绿色荧光蛋白在触摸响应MEC神经元4,5。这些神经元具有沿体壁运行，很容易拿下的形态异常漫长的过程。此外，本形态的信息可与神经元功能的行为的措施相结合，如上所述。可用于这个目的的一个菌株是TU2583，这是可从下线虫遗传学中心，包含uIs25集成来回的转基因表达绿色荧光蛋白米的MEC-18启动子，或者TU2562，其中包含一个集成的MEC-3 :: GFP融合。 准备琼脂糖垫。 熔化的2％琼脂糖中的水，使1倍M9用10倍的库存，并保持溶液在70℃下把该溶液的载玻片上（25毫米×75毫米）一滴（约20微升）已放置其他两个幻灯片，其中每一个具有一个单件的磁带在其底侧之间。 将垂直于第一在2％琼脂糖溶液之上的最后搏命，并让它冷却室温。这应该形成一个垫，它是带的厚度。 卸下顶部的幻灯片，并添加10微升的M9含0.1％四咪唑，将固定的蠕虫。 将部分（〜10）生活蠕虫到2％琼脂糖幻灯片。将盖玻片超过他们，并使用下一个目标100X荧光显微镜用适当的照明GFP可视化。 破损神经元将呈现珍珠模式中的处理的胞质膜的字符串，由多个泪点（ 图2A）的，和/或异常，其中过程出现折断（ 图2B）。计数泪点和异常两种神经元对每个虫，总共使用了至少10蠕虫。 8。实验室自制缺氧商会特百惠式的，密封的，密封的容器可以被改造为缺氧室。注意要选择一个容器，是尽可能小。一个小容器创建一个缺氧的环境更快，更容易适应在水浴中（ 图4）。 使两个孔上的盖子（可以用螺丝刀或镊子加热并强制进入盖完成），并插入一个适合的管（ 图5A）的塑料或金属连接器。使用胶水，可以放置在水中，也变得硬干燥后，避免了运动该连接器，从而减少泄漏的可能性（ 图5B）。 该容器应放入水浴使其完全浸没（ 图4）。浸泡容器中，用奶瓶重量或潜水的重量。 一项所述的管连接将被用于引入气体混合物，而另一管将作为一个压力释放，因此它应在水中留下，以便将容器从外部环境（ 图4）封闭。 空气组合物可以通过使用定制的气体质量流量控制器或混合了所需的气体的任何装置进行调制。气体流应加以控制，如高流动可以建立过度蒸发。例如，在一个250ml的容器中，气体为100ml /分将提供的蠕虫良好的空间和合适的助焊剂。 管子的长度应保持在最低限度，因为它们可以是可渗透的气体，一llowing的O 2的入口。避免使用有机硅是很重要的，聚乙烯离心管，因为这些材料是可渗透的气体交换。我们宁愿聚丙烯或尼龙管。玻璃或金属管保持气体很好，但也很难一起工作。