막 극성, 멤브레인 무결성 및 세포 내 이온 농도의 모니터링 변경<em> 폐렴 구균</em> 형광 염료를 사용

우리 연구실은 종양 세포의 세포 사멸을 유도 (종양 세포에 치명적인 만든 인간의 알파 – 락트 알부민을위한) 햄릿이라는 인간의 우유에서 단백질 지질 복합체를 확인뿐만 아니라, 세균 종 ^1,2의 다양한 죽일 수있다. 특히 민감한 것으로 발견 된 종은 최대 감도와 죽음 ^2,3의 세포 사멸과 같은 표현형을 표시하는 폐렴 구균 (폐렴 구균)와 호흡 기관을 대상으로 그들이었다. 막 탈분극과 특정 이온 전송 이벤트는 잘 설명하고 방사성 TPP ⁺ 이온과 JC-1과 TMRE 등의 형광 염료는 미토콘드리아 막 ^3의 탈분극을 설명하는 데 사용 된 미토콘드리아, 특히 진핵 세포에서 세포 사멸 중에 중요한 이벤트 ^-5. 따라서, 우리는 우리가 우리의 노력을 집중으로 폐렴 구균 이러한 막 관련 기능에 햄릿의 효과에 대한 자세한 내용을 보려면 모색그 과정에서 새로운 항균 치료 또는 백신 후보를 식별하기위한 큰 잠재력을 가진 박테리아의 세포 사멸과 같은 표현형의 기계적 구성 요소의 더 나은 이해를 개발할 수 있습니다.

우리 역학적 연구를위한 프로토콜을 확립하고자, 우리는 진핵 시스템에서 잘 설명 된 방법론 달리 박테리아 막 ^6,7의 전기 생리학 및 이온 수송 메커니즘을 상세히 거의 발표 된 연구가 있다는 것을 발견했다. 이것은 주로 작은 미생물의 크기와 그 표면 구조, 거 원형질체를 사용하여 일부 연구는 혼합 성공적으로 수행되었지만 특히 칸막이 벽의 존재, 즉, 패치 클램프 같은 종래 진핵 방법의 사용을위한 멤브레인의 접근성을 제한에 기인 ^8,9. 그것은 사람을 필요로하기 때문에 이러한 거대한 원형질체와 작업은 대부분의 세균 종을위한 이상적인 또는 실용적인 방법이 아니므로ipulated 박테리아 부자연 및 비 생물 적 상태에서 수행 된 박테리아 막 극성의 한정된 연구는 주로 유세포 분석기를 사용하고 형광 시아닌 및 옥소 놀 염료의 사용은 ^10-16.

하나의 시점에 하나의 박테리아에서 개별 형광 판독 값을 수집하는, 유동 세포 계측법 대신에, 우리는 시간이 지남에 따라 96 – 웰 플레이트 형식으로 세균 현탁액의 형광 강도를 검출하는 형광 검출 플레이트 판독기를 사용하여 선택 하였다. 이것은 훨씬 더 단순 다양한 시점에서 박테리아의 인구를 치료하고 완화, 지속적으로 유동 세포 계측법 사용하여 달성하기 어려운 시간의 연장 기간에 전체 인구의 형광 반응 속도를 모니터링 할 수있었습니다. (미토콘드리아와 함께 사용하기 위해 상기 언급 된 것 등) 전위에 민감한 형광 염료의 다양한 테스트 후에, 우리가 사용하는 최상의 기술 및 실제 성공을 달성DiBAC _4라는 비스 – 옥소 놀 염료 (3) (비스 – (1,3 – dibutylbarbituric 산) trimethine의 옥소 놀) 극성의 변화를 모니터링 할 수 있습니다.

우리는 또한 귀중한 동시에 요오드화 프로피 듐 (PI)을 사용하여 멤브레인의 무결성을 모니터링하기 위해 중단되었다고. 이 염료는 핵산에 결합에 형광하지만, 세균 세포막의 무결성이 그 라이브 죽은 염색 분석에 죽은 세포를 감지하는 데 사용되는 인기있는 구성 요소 만들기, 손상되었을 때 그렇게 만 할 수 있습니다. PI 이외에, SYTOX 녹색과 TO-PRO-1 액션 유사하며, 이전에 검출 방법 ¹⁷ 유동 세포 계측법을 사용하여 몇 가지 연구에서 박테리아에 사용 된 형광 염료이다. 우리는 때문에 우리는 주어진 샘플에서 DiBAC과 동시에 자사의 형광을 모니터링 할 수는 여기 파장에 PI를 사용하기로 결정했습니다.

우리의 연구에서, 우리는 햄릿뿐만 아니라 살균 작용을 가진 다른 관련 단백질 – 지질 복합체를 관찰폐렴 구균 ^3,18,26의 치료시 두 염료의 형광의 증가로 표시된 바와 같이 세균 막 ELOA 유도 탈분극과 파열로 알려져 있습니다. 두 착물을 위해, 우리는 DiBAC _(4)의 형광 강도 (3) 탈분극 파열 이전에 발생했음을 나타내는 전에 PI의 강도 증가로 증가하고 있음을 관찰 그러므로, 우리의 살균성 단백질 – 지질 복합체에 의해 유도 된 특정 이벤트 관심. 이 구별은 막의 파열 자체가 특이 탈분극을 일으킬 수 있도록하는 것이 중요합니다. DiBAC _4를 모두 측정 및 분석 (3) 및 PI 형광 반응 속도는 동시에 우리는 형광 측정을 사용하는 대신에 유동 세포 계측법의 추가 이점이 두 개의 막 이벤트 사이의 관계를 조사 할 수 있었다.

세균 이온 플럭스를 모니터링하기 위해,의 이해를 측정하는 등의 방사성 동위 원소를 사용하여 몇 가지 이전의 성공이 있었다45 카 우리는 또한 우리의 최근의 연구 ^{(18), (21)에} 사용한 폐렴 구균 ^{19, 20, 2 +.} 그러나 이러한 방사성 이온으로 작업하는 몇 가지 단점이 있습니다. 그들은 비용이 많이들 수 있습니다, 시간이 많이 소요하고, 지저분한, 또한 관심의 동위 원소에 따라, 해를 실험을 수행하는 개인을 노출 할 수 있습니다. 또한, 시간이 지남에 급격한 변화를 모니터하는 것은 곤란하다. 따라서, 우리는 이온 성 형광 표시기 염료의 아세 (AM) 에스테르 버전을 사용 측정하는 다른 방법을 향하고. 그 자체로, 지시 염료가 충전되어 쉽게 막을 통과하지 않지만, 친 유성 에스테르 기의 추가와 함께, 현재 대전 된 분자는 세균의 세포막을 통과 할 수있다. 내부에 들어 서면, 세균 에스 테라 제는 충전을 다시 크게 셀을 종료 할 수있는 능력을 둔화 및 허용 염료 T 세포 내부 무료 염료를 떠나, 에스테르 그룹을 절단하고O는 시간이 지남에 따라 내부에 축적된다. 그러나 이러한 에스테르 염료의 사용은로드, 감지, 성공의 다양한 방법으로, 세포 내 칼슘 ^{2 + 22 ~ 24과} H ^{+ 16의} 변화를 감지하는 몇 종의 박테리아에 설명되어 있습니다.

세포 내 칼슘의 변화를 모니터하는 욕망 ^{2 +와} S.에도 K ^+와 H ⁺ 레벨 폐렴은 햄릿과 다른 화합물과 치료에, 우리는 성공적으로 효율적으로 박테리아 세포에 형광 표시기 염료를로드하는 프로토콜을 만들었습니다. 음이온 수송 및 PowerLoad, 적재 효율을 증가 생명 기술의 독점적 인 화합물을 차단하여 색소 보존을 증가 모두 프로 베네 시드를 요구 박테리아에 효과적인로드. (K ^+을 검출)은 fura-2/AM 중 (Ca ^{2 +을} 검출), PBFI / AM, 및 BCECF / AM (H의 ^+를 검출)을 성공적으로 캡슐화 및 캡슐화 모두 폐렴 구균 성으로로드 된형광 검출 플레이트 리더 ^{18, 21을} 사용하여 (K ⁺ uncoupler)와 CCCP (H ⁺ uncoupler을) 발리 노마 이신 (Valinomycin) 등 이오 노마 이신 (칼슘 ^{2 +} uncoupler) 등 ionophores, 첨가 한 후, 그 결과 형광 패턴의 측정을 가능하게 비.