Monitoring Veranderingen in Membrane Polariteit, Membraan Integriteit, en intracellulaire Ion concentraties in<em> Streptococcus pneumoniae</em> Het gebruik van fluorescente kleurstoffen

Ons laboratorium heeft een eiwit-lipide complex van moedermelk genoemd GEHUCHT (voor humaan alfa-lactalbumine gemaakt dodelijk tumorcellen) die apoptose induceert in tumorcellen geïdentificeerd, maar kan ook een verscheidenheid van bacteriële species ^1,2 doden. De soorten die bleken bijzonder gevoelig te zijn die de luchtwegen richten, met Streptococcus pneumoniae (pneumokok de) tonen de grootste gevoeligheid en een apoptose-achtige fenotype dood ^2,3. Membraan depolarisatie en specifieke ionentransport gebeurtenissen zijn goed beschreven en cruciale gebeurtenissen gedurende geprogrammeerde celdood in eukaryote cellen, vooral in de mitochondriën, waar radioactieve TPP ⁺ ionen en fluorescente kleurstoffen zoals JC-1 en TMRE zijn gebruikt om depolarisatie van de mitochondriale membraan ³ tonen ^-5. Dus zochten we om meer te leren over het effect van gehucht op deze membraan-gerelateerde functies in de pneumokok als we onze inspanningen gericht opontwikkelen van een beter begrip van de mechanische componenten van de apoptose-achtig fenotype in bacteriën, met grote mogelijkheden voor het identificeren van nieuwe antibacteriële therapie of vaccinkandidaten in het proces.

Bij het ​​streven naar de vaststelling van protocols voor onze mechanistische studies, ontdekten we dat in tegenstelling tot de goed beschreven methodiek in eukaryote systemen, zijn er zeer weinig gepubliceerde studies detaillering elektrofysiologie en ionen transport mechanismen van de bacteriële membraan ^6,7. Dit wordt voornamelijk toegeschreven aan de kleinere omvang van micro-organismen en hun oppervlak architectuur, met name de aanwezigheid van celwand, dat beperkt de toegankelijkheid van het membraan voor gebruik van conventionele methoden zoals eukaryotische patchklemmen, hoewel sommige studies met grote protoplasten uitgevoerd met wisselend succes ^8,9. Naarmate het werk met deze gigantische protoplasten is niet een ideaal of zelfs praktische methode voor de meeste soorten bacteriën, omdat het de mens nodig heeftipulated bacteriën in een onnatuurlijke en abiotische toestand, de beperkte studies van bacteriële membraan polariteit die zijn uitgevoerd zijn voornamelijk werkzaam flowcytometrie en gebruik van cyanine en oxonol fluorescente kleurstoffen ^10-16.

In plaats van flowcytometrie, die individuele fluorescentie metingen verzamelt ve bacterie op een enkel tijdstip, kozen we een fluorescentiedetectie plaatlezer om fluorescentie-intensiteit van bacteriële suspensies detecteren in een 96-putjes tijd. Zo konden we een populatie van bacteriën op verschillende tijdstippen met veel grotere eenvoud en gemak, en continu de fluorescentie kinetiek van de gehele bevolking voor langere tijd, hetgeen moeilijk te bereiken met flowcytometrie. Na het testen van een grote verscheidenheid van potentiële gevoelige fluorescente kleurstoffen (waaronder de genoemde voor gebruik met de mitochondria), bereikten wij de beste technische en praktische succes met debis-oxonolkleurstof DiBAC genoemd ₄ (3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethineoxonol) veranderingen in polariteit controleren.

We vonden ook waardevol gelijktijdig verstoringen in de integriteit van het membraan te controleren met propidium jodide (PI). Deze kleurstof fluoresceert bij binding aan nucleïnezuur, maar is alleen in staat om dat te doen als de integriteit van de bacteriële membraan wordt aangetast, waardoor het de populaire component gebruikt om dode cellen te detecteren in levende-dode kleuring assays. Naast PI SYTOX groen en TO-PRO-1 fluorescerende kleurstoffen die qua actie en zijn eerder voor bacteriën in enkele studies met flowcytometrie detectiemethoden ^17. We kozen ervoor om PI te gebruiken vanwege de golflengte die ons toeliet om de fluorescentie monitoren gelijktijdig met DiBAC in een bepaald monster.

In onze studies hebben we GEHUCHT, alsmede andere verwante eiwit-lipide complex met bactericide activiteit waargenomenbekend als Eloa, geïnduceerde depolarisatie en breuk van het bacteriële membraan, zoals aangegeven door een toename in de fluorescentie van beide kleurstoffen bij behandeling van pneumokokken ^3,18,26. Voor beide complexen waargenomen dat de fluorescentie-intensiteit van DiBAC ₄ (3) verhoogd vóór de toename in intensiteit van PI, wat aangeeft dat depolarisatie zich vóór scheuren en is daarom een specifieke gebeurtenis veroorzaakt door onze bactericide eiwit-lipide-complexen van belang. Dit onderscheid is belangrijk te maken, als breuk van het membraan kan zelf leiden tot niet-specifieke depolarisatie. Meten en analyseren van zowel DiBAC ₄ (3) en PI fluorescentie kinetiek gelijktijdig konden we de relatie tussen de twee membraanlagen gebeurtenissen, wat een extra voordeel van fluorometrie plaats van doorstroomcytometrie onderzocht.

Om bacteriële ionenflux bewaken, is er een aantal eerdere succes met het gebruik van radio-isotopen, waaronder het meten van de opname van45 Ca ^{2 +} in de pneumokok ^19,20, die we ook hebben gebruikt in onze recente studies ^{18, 21.} Het werken met deze radioactieve ionen heeft een aantal nadelen. Ze kunnen duur, tijdrovend en rommelig, en kan ook het individu bloot uitvoeren van het experiment te schaden, afhankelijk van de isotoop van belang. Bovendien is het moeilijk om snelle veranderingen tijdig te signaleren. Zo hebben we gedraaid naar een andere manier van meten die acetoxymethyl (AM) ester versies van ionen-gevoelige fluorescente indicator kleurstoffen werken. Op zichzelf is de indicatorkleurstof opgeladen en niet gemakkelijk door het membraan, maar met de toevoeging van de lipofiele estergroep, kan nu ongeladen moleculen door het membraan van de bacterie. Bij binnenkomst in de inrichting, de bacteriële esterasen splitsen de estergroep, vrij blijft de kleurstof in de cel en opnieuw geladen, zijn vermogen om de cel te verlaten aanzienlijk vertragen en waardoor de kleurstof to ophopen in de tijd. Echter, het gebruik van deze kleurstoffen ester is slechts in enkele bacteriesoorten beschreven veranderingen in intracellulaire Ca ^{2 + 22-24} en H ^{+ 16} sporen met verschillende methoden laden, detectie, en succes.

Met een verlangen om veranderingen in intracellulaire Ca ^{2 +} monitoren en ook K ⁺ en H ⁺ niveaus in S. pneumoniae na behandeling met HAMLET en andere verbindingen, we succesvol aangemaakt protocollen om efficiënt te laden fluorescerende indicator kleurstoffen in bacteriële cellen. Effectieve laden in bacteriën vereist zowel probenecide dat kleurstofretentie stijgt met anion-transporteurs en PowerLoad, een eigen verbinding van Life Technologies dat laden efficiëntie verhoogt blokkeren. Fura-2/AM (detecteren van Ca ^{2 +),} PBFI / AM (detecteren van K ^+), en BCECF / AM (detecteren van H ⁺⁾ werden met succes in zowel niet-ingekapselde en ingekapselde pneumokokken st geladenregens waarmee meting van de resulterende fluorescentie patronen na toevoeging van ionoforen zoals ionomycine ^{(Ca2 +} ontkoppelaar), valinomycine (K ⁺ ontkoppelaar) en CCCP (H ⁺ ontkoppelaar) met fluorescentie detectie plaatlezer ^{18, 21.}