メンブレン極性膜完全性、細胞内イオン濃度の監視の変更<em>肺炎球菌</em>蛍光染料を使用

我々の研究室では、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する（腫瘍細胞に対して致死メイドヒトα-ラクトアルブミンの場合）HAMLETというヒト乳由来のタンパク質-脂質複合体を同定するだけでなく、細菌種^の1,2種々を殺すことができるしている。特に敏感であることが判明した種は、最大の感度と死^2,3のアポトーシス様表現型を示す肺炎球菌 （肺炎球菌）で、気道を標的とするものだった。膜脱分極および特定のイオン輸送イベントは、真核細胞におけるアポトーシスの間に十分に説明され、重要なイベントである、放射性TPP ⁺イオンおよびJC-1とTMREを含む蛍光色素は、ミトコンドリア膜³の脱分極を示すために使用されてきたミトコンドリア、特に^-5。そこで、我々は我々の努力を集中として肺炎球菌におけるこれらの膜関連機能に対するハムレットの影響についての詳細を学ぶために求められてプロセスにおける新規抗菌治療法やワクチン候補を識別するための大きな可能性を秘めた、細菌におけるアポトーシス様の表現型の機構部品のよりよい理解を開発しています。

我々の機構的研究のためのプロトコルを確立しようと、我々は、真核生物系において十分に記載された方法論とは対照的に、細菌膜^6,7の電気生理学およびイオン輸送メカニズムを詳述した非常に少数の公開された研究があることを発見した。これは主に小さい微生物の大きさとその表面構造、巨大プロトプラストを用いたいくつかの研究は、混合成功を用いて実施したが、特に細胞壁の存在、すなわち、パッチクランプ法のような従来の真核生物の方法を使用するための膜のアクセスを制限することに起因する^8,9。それは人間を必要とするため、これらの巨大プロトプラストとの仕事は、ほとんどの細菌種のための理想的な、あるいは現実的な方法ではないので、ipulated細菌は、非天然および非生物状態で、実行された細菌細胞膜の極性の制限された研究は、主に、フローサイトメトリーを採用しており、シアニン、オキソノール蛍光染料の使用は^、10-16。

単一時点に一つの細菌から個々の蛍光測定値を収集する、フローサイトメトリーの代わりに、我々は、時間の経過、96ウェルプレート形式で細菌懸濁液の蛍光強度を検出する蛍光検出プレートリーダーを使用することを選択した。これは、はるかに大きく単純かつ容易に種々の時点での細菌の集団を処置するため、連続的フローサイトメトリーを用いて達成することは困難であり、長期間にわたって集団全体の蛍光動力学を監視することができた。 （ミトコンドリアと共に使用するための上記のものを含む）の電位感受性蛍光色素の様々なテストした後、我々は、使用した最高の技術的かつ実用的な成功を達成し極性の変化を監視するDiBAC ₄と呼ばれるビス-オキソノール色素（3）（ビス- （1,3 -ジブチル酸）トリメチンオキソノール）。

我々はまた、貴重同時に、ヨウ化プロピジウム（PI）を用いて、膜の完全性の混乱を監視することを見出した。この色素は、核酸に結合すると蛍光を発するが、細菌細胞膜の完全性は、それ生死染色アッセイにおいて、死細胞を検出するために使用される一般的成分作り、危険にさらされたときにこれを行うことができるだけである。 PIに加えて、緑色およびTO-PRO-1、SYTOXアクションが類似していると以前にフローサイトメトリー検出法^17を用いて、いくつかの研究中の細菌のために使用されている蛍光染料である。私たちは、私たちは与えられたサンプル中DiBACと同時にその蛍光をモニタリングすることができ、その励起波長にPIを使用することにしました。

我々の研究では、我々は、ハムレットのほか、殺菌作用を持つ別の関連タンパク質 – 脂質複合体を観察している肺炎球菌^3,18,26の処理時の両方の色素の蛍光の増加によって示されるように、細菌の膜の脱分極や破裂を誘発さELOA、として知られている。両方の複合体のために、我々はDiBAC ₄の蛍光強度（3）脱分極が破裂する前に発生したことを示す、前のPIの強度の増加に増加し、であることが観察され、したがって、我々の殺菌性タンパク質-脂質複合体により誘導される特定のイベントインタレスト。この区別は、膜の破裂などの自体が非特異的な脱分極を引き起こす可能性があり、確認することが重要です。測定及び分析の両方DiBAC _4（3）及びPI蛍光動態同時にボランティア蛍光法の代わりに、フローサイトメトリーを使用することのさらなる利点である二つの膜事象との間のこの関係を調べることができた。

細菌イオン流出を監視するには、の取り込みを測定するなど、放射性同位元素を使用して以前のいくつかの成功があった45 Caの我々はまた、我々の最近の研究^18、21で使用した肺炎球菌^{19,20、2 +。}しかしながら、これらの放射性イオンでの作業は、いくつかの欠点を有する。彼らは、高価な時間がかかり、厄介であることができ、また、目的の同位体に依存して、危害を加える実験を行う個体を露出させることができる。さらに、それは経時的に急激な変化を監視することは困難である。したがって、我々は、イオン感受性蛍光指示薬色素のアセトキシメチル（AM）エステルのバージョンを採用して測定する別の方法の方を向いて。単独で、指示色素が充電され、容易に膜を通過しないが、親油性のエステル基を加えて、今非荷電分子は細菌の膜を通過することができる。内部に入ると、細菌エステラーゼは有意に細胞を終了する能力を遅らせ、染料tを可能にする、細胞内の遊離し、再荷電染料を残して、エステル基を開裂Oは、時間の経過とともに内部に蓄積されます。しかしながら、これらのエステル色素の使用は、負荷検出、および成功種々の方法を用いて、細胞内Ca ^{2 +} H ^{+ 22-24}と¹⁶の変化を検出するために、いくつかの細菌種に記載されている。

細胞内Ca ^{2 +}の変化やS.においても、K ⁺及びH ⁺レベルを監視したいという要望とハムレットおよび他の化合物で処理すると、肺炎は 、我々が正常に効率的に細菌細胞に蛍光指示薬色素をロードするためのプロトコルを作成しました。陰イオントランスポーターとPowerLoad、積載効率を高めライフ·テクノロジーズからの独自の化合物をブロックすることにより、色素の保持を増加させ、両方のプロベネシドを必要とした細菌に効果的なローディング。 （K ^+を検出）のFura-2/AM（Ca ^{2 +}の^検出 ）、PBFI / AM、およびBCECF / AM（のH ^+を検出）が成功裏にカプセル化されていないと、カプセル化の両方肺炎球菌STにロードされた蛍光検出プレートリーダー^18、21を用いて（K ⁺脱共役剤）およびCCCP（H ⁺共役剤）をバリノマイシン、例えばイオノマイシン（Ca ^{2 +}の脱共役剤）などのイオノフォア、添加後に得られた蛍光パターンの測定を可能にする雨。