농약침과 PVX 농병은 식물에 있는 유전자의 일시적인 자궁 발현을 위한 일상적인 기능적인 분석입니다. 이 방법은 효과적인 전략 (급속한 저항 및 비열유전자 발견)에 있는 능률적인 연구및 분자 식물 병리학에 있는 현대 연구에 결정적입니다. 그들은 공장에서 강력한 고처리량 기능 분석에 대한 수요를 충족합니다.
농약침및 PVX 농병소는 식물에 있는 후보 유전자의 기능적 분석을 위한 2개의 능률적인 일시적인 발현 분석이다. 농구침을 위해 가장 일반적으로 사용되는 에이전트는 많은 디코트 식물 종의 병원체인 아그로박테리움 tumefaciens입니다. 이것은 농약 침전이 많은 식물 종에 적용될 수 있다는 것을 의미합니다. 여기서, 우리는 감자(솔라눔 tuberosum),관련 야생 결핵 베어링 솔라눔 종(솔라눔 섹션 Petota)과모델 식물 니코티아나 벤타미안에이러한 방법을 적용 할 때 우리의 프로토콜과 예상 결과를 제시한다. 저항성(R)또는 avirulence(Avr) 유전자와 같은단일 유전자의 기능적 분석 외에도, 농약침 분석은 단순히 R 및 Avr 전진을 동일한 세포로 전달함으로써 특정 숙주 병원체 상호 작용과 관련된 R-AVR 상호 작용을 재구성하는 데 매우 적합합니다. 그러나, 몇몇 식물 유전형은 우리가 몇몇 감자 유전자형에 대해 예를 들었던 바와 같이, Agrobacterium에비특이적인 방어 반응을 올릴 수 있습니다. 농약침과 비교하여 PVX 농약으로 AVR 활동을 감지하는 것은 기능성 스크린에서 더 민감하고, 더 높은 처리량이며, Agrobacterium에대한 비특이적 방어 응답에 덜 민감하다. 그러나 PVX에 대한 비특이적 방어가 발생할 수 있으며 바이러스유발 극단적인 저항으로 인해 응답을 놓칠 위험이 있습니다. 이러한 한계에도 불구하고, 우리의 경험에서, 농침과 PVX 농병은 서로의 결과를 확인하기 위해 동시에 사용할 수있는 적합하고 보완적인 분석입니다.
이펙토로믹스, 고처리량 기능유전체학 접근법은 최근 작물 식물에서내성(R)유전자를 식별하고병원균의유전자(Avr)유전자를 식별하는 강력한 도구로 부상하고 있다. R 유전자를 가진 더 많은 시간 소모적인 안정한 변환과는 대조적으로, 이펙소학 전략은 병원체 유전자 서열의 일시적인 분석에 근거를 두고 있습니다.
유전체학 시대 부터 식물 병원균의 게놈이 널리 탐구되었습니다. 예를 들어 가장 파괴적인 식물 병원균을 포함하는 oomycetes를 위해, 식물5-10과의상호 작용 도중 역할을 하는 유전자를 위해 서열의 큰 집합이 생성되고 분석되었습니다. 병원체 단백질의 한 클래스는 감염 (독성 요인)을 용이하게하거나 방어 반응 (비보렌스 인자)11-13을트리거하기 위해 숙주 세포 구조와 기능을 조작하는 이펙터를 나타낸다. R 유전자를 포함하는 식물 세포에서 Avr 유전자의 발현은 일반적으로 과민성 세포 사멸 반응 (HR)14,15의결과를 낳는다. R 및 Avr 유전자의 질문 발현에서 아그로박테리움 투메파시엔과같은 일시적인 발현 시스템을 사용하여 달성될 수 있다- 기반과도 변환(agroinfiltration)16. 이러한 일시적인 변환은 또한 바이러스 발현 시스템(agroinfection)17,18과함께 적용될 수 있다.
농구침의 경우, 가장 일반적으로 사용되는 제제는 디코 식물의 광범위한 숙주 범위 병원균인 A. tumefaciens입니다. A . tumefaciens는 종양 유도 (Ti) 플라스미드를 포함합니다. 티 플라스미드로부터 의 전DNA(T-DNA)는 박테리아의 독성 기계가 활성화된 후 식물 세포로 전이된다. 이는 상처입은 식물 세포에서 발동될 수 있으며, 약간 산성 환경에서 방출된 저분자-중량 페놀 화합물 및 단색차르에 의해19일. 독성 유전자는 주요 정맥에 의해 정의된 잎 패널로 Agrobacterium 현탁액의 침투 후에 활성화됩니다. 그런 다음 잎 패널내의 식물 세포가 T-DNA 영역에 포함된 트랜스진을 변형시키고 발현하게 됩니다.
농병은 세포를 심기 위하여 바이러스의 전좌를 중개하는 상처 접종한 Agrobacterium를기반으로 합니다. 바이러스는 그 때 Agrobacterium의부재에, 인접 한 식물 조직에 더 확산. 농가 감염의 경우 여러 식물 바이러스를 사용할 수 있습니다. RNA 바이러스는 감염된 식물에서 매우 높은 수준으로 증식할 수 있기 때문에 유전자 발현에 이상적인 벡터입니다. 식물 RNA 바이러스 중, 감자 바이러스 X (PVX)는 이펙소로믹스 스크린에 널리 사용된다. 삽입된 유전자에 대한 기능성 검사를 용이하게 하기 위해 콜리플라워 모자이크 바이러스(35S 프로모터)와 노팔린 신타제 터미네이터에 의해 측면에 있는 PVX 게놈을 포함하는 이진 벡터는 A.tumefaciens20의T-DNA로 복제되었다. T-DNA가 식물 세포로 옮겨진 후, T-DNA에 포함된 PVX 게놈은 35S 프로모터로부터 전사된다. 그런 다음 바이러스 입자가 감염된 식물에서 체계적으로 퍼지고 삽입된 유전자의 발현을 초래합니다. 이 방법은 아그로박테리움과 PVX를 기반으로 PVX 농사독이라고 합니다.
여기서 우리는 농아침투와 PVX 농소소 소독 소사 모두에 대한 예를 보여줍니다. 호스트 식물로서 우리는 감자 세균(솔라눔 섹션 Petota)을사용하며, 이펙토로믹스 접근법이 개척되어3,4의성공을 입증했습니다. 우리는 또한14,21,22의 솔라나체 식물의 모델 공장으로 유명한 니코티아나 벤타미안을사용합니다.
농약과 농병과 같은 일시적인 연구는 현대 분자 식물 병리학 연구에 필수적인 효율적인 방법입니다. 몇 가지 제한에도 불구하고 이러한 방법은 플랜트에서 효율적이고 견고한 고처리량 기능 분석에 대한 수요를 충족시다.
농구침 시스템은 식물 종의 범위에서 널리 사용되는 기능 분석이다. 농약은 상호 작용하는 단백질의 동시 발현을 가진 몇몇 전간 유전자의 전달을 동일 세포로 전달하는 것을 용이하게 합니다. 이것은 일치하는 R 유전자를 표현하는 긴장으로 Avr 유전자를 표현하는 Agrobacterium 균주를 동전으로 하여 R-AVR 관계를 재구성하는 데 유리합니다. 또한 알려진 R-AVR 쌍의 경우 이러한 코인 여과를 긍정적 인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 일부 식물 유전자형에서는 변환 효율이 응답을 감지하기 위해 임계값 이하로 있을 수 있기 때문에 이러한 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다. 부정적인 대조를 포함하되, 예를 들어 유전자 삽입 없이 벡터를 함유하는 Agrobacterium 균주는 특정 식물 유전자형이 Agrobacterium에대한 비특이적 방어 반응을 제기하는지 여부를 결정하는 데 필수적이다. 이 기능은 감자 세균의 특정 주파수에서 발생하며 모든 솔라넘 종이 이 Agrobacterium기반 발현 시스템에 적합하지는 않습니다. 일반적으로, 농약 침투 분석은 N. 벤타미안과 대부분의 감자 유전자형에서 아주 잘 작동합니다. 이펙타로믹스 외에도, 공초점 현미경에 의한 식물 세포에서 트랜스게놈및 단백질 국소화에서 단백질의 생산과 같은 농구침 기술에 대한 다양한 잠재적 응용 이있다.
PVX 농병은 고감도 스크리닝 시스템이며 일반적으로 고처리량 스크리닝에 더 적합합니다. Agrobacterium은 지금 단지 로컬 존재 이기 때문에, 이 박테리아에 비특이적인 반응은 지금 아주 방해하지 않습니다, PVX 바이러스는 질균의 추가 퍼짐을 인수하기 때문에. 그러나, 식물은 PVX에 내성이 있거나, 극단적인 저항(ER) 반응을 탑재할 수 있으며, 이 경우 농아소독 방법이 적합하지 않다. PVX 농사감염 방법의 또 다른 제한은 관심 있는 유전자의 삽입 크기이다. 관찰된 표현형의 반응은 상처를 둘러싼 강렬한 흑괴사에서 접종 지점 근처의 희미한 괴사에 이르기까지 다양할 수 있다. N. 벤타미나와 솔라눔 종 모두에서 PVX 농소독은 농구침보다 더 민감하다는 것을 인식합니다.
다양한 테스트 된 식물 유전자형의 유전 적 배경이 몇 가지 제한이있을 수 있다는 점을 고려하여 (위 참조), 우리는 일반적으로 PVX 농가 감염 및 농생물 침투에 의해 유사한 결론을 얻을. 이러한 결과는 또한 단백질침투(29) 및 ELISA3과같은 다른 애사에서 얻은 것과 비교할 수 있다. 두 시스템의 장점과 한계를 고려하여 두 방법을 모두 사용하여 서로를 보완하거나 독립적인 결과를 확인하는 것이 좋습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 와게닝겐 대학 기금(WUF), 대학원생을 위한 중국 장학위원회 프로그램, NWO-VIDI 교부금 12378에 의해 부분적으로 지원됩니다.
Beef extract | Sigma-Aldrich | B4888 | |
Bacteriological peptone | Oxoid | LP0037 | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
MS salts (without vitamins) | Duchefa Biochemie | M0221 | |
MES | Duchefa Biochemie | M1503 | |
LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 300013 | |
Incubator | Infors HT | Multitron II | |
Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
Spectrophotometer | Eppendorf | Biophotometer 6131 |