Isolering av myeloid dendrittiske celler og Epitelceller fra Menneskelig Thymus

I thymus er det organ, der forekommer T-celleutvikling. Den relative og absolutte størrelse avtar med alderen når den blir suksessivt erstattet av fett, selv om thymisk aktivitet kan fremdeles påvises i høy alder. Dens betydning for immunrespons ble vist i begynnelsen av 1960-tallet ^en.

T-celle repertoar er formet gjennom samspillet av T-celle reseptorer med peptid-MHC komplekser på ulike typer thymic APC, som gir overlevelse eller død signaler for å utvikle T-celler, noe som resulterer i en funksjonell og i stor grad selv tolerant T celle repertoar ^to.

Omtrent 98% av cellene i en human thymus utvikler T-celler omtales som thymocytter. De resterende 2% bestå av en rekke forskjellige celletyper, inkludert en rekke TEC (cortical, medullær, subkapsulær), myeloid-og plasmacytoid DC (MDC, PDC), makrofager, B-celler, modne re-sirkulerende T-celler, granulocytter, fibroblasts, endotelceller og meget sjeldne epitelceller med et uttrykk fenotype som ligner på celler fra andre vev som muskel, nerveceller og respiratorisk epitel (figur 1). Av disse TEC og DC er de store APC typene som finnes i en normal thymus. I de senere årene, har rensingen av disse APC typer for kultur og molekylær profilering fått mer og mer interesse. På grunn av deres lave frekvens, isolering av en hvilken som helst av disse celletypene for detaljert analyse krever en effektiv, reproduserbar og kostnadseffektiv fremgangsmåte. Metoden som presenteres her er en modifikasjon fra tidligere publiserte studier ^3,4.

Som med alle andre vev, kan celleutvinning fra thymus oppnås ved enzymatisk disaggregating celle-celle og celle-matriks-interaksjon nettverk, for å oppnå en suspensjon av enkeltceller. Det er visse parametre som god dissosiasjon effektivitet, celleytelse celleviabilitet og oppbevaring av celle surface markører som er avgjørende, og må være optimalisert for en vellykket isolering av disse sjeldne cellepopulasjoner.

I denne protokollen, er isolasjon av DC og TEC-undergrupper utføres ved å lage en enkeltcellesuspensjon av vev ved mekanisk forstyrrelse og enzymatisk oppslutning. Vi bruker Collagenase A fra Clostridium histolyticum, som har et balansert forhold mellom forskjellige enzymaktivitet, for å bryte ned de opprinnelige kollagen som inneholder vev sammen. DNase I er inkludert i enzymløsningen for å redusere celle aggregering på grunn av fri-DNA fra døde celler (thymocytter er svært følsomme). Vi har også en alternativ tilnærming til den typiske enzymatisk fordøyelse vev involverer mekanisk og enzymatisk behandling vev assistert av en vev dissociator. Enkeltcellesuspensjonen blir deretter utsatt for en enkelt densitet Percoll sentrifugering for anriking av lavtetthets fraksjon (LDF) av celler. Fra denne fraksjonen av celler, kan like isoleres ved farging feller DC-overflatemarkører (dvs. CD11c ⁺⁾ og ved hjelp av magnetisk separasjon eller fluorescens-aktivert celle sortering (FACS). I motsetning til de lymfoide celler som utgjør det store flertallet av celler i thymus, trenger TEC ikke uttrykke CD45 på høye nivåer, men er positivt for epithelial celleadhesjonsmolekylet EpCAM. CTEC kan skilles fra medullær TEC av uttrykket av en udefinerbar antigen gjenkjennes av CDR-2 (kortikale dendrittiske retikulocytter-2) antistoff ^4,5 og noe lavere EpCAM uttrykk. Differensial co-uttrykk for EpCAM og CDR2 tillater effektiv isolering av disse TEC undergrupper via høyhastighets celle sortering ^seks.

Protokollen presenteres her er optimalisert for menneskelig thymic vev. Varigheten av fremgangsmåten er avhengig av mengden av vev og evne til experimenter, så vel som hastigheten av cellesortering, hvis FACS sortering benyttes. Normalt kan protokollen for isolering av DC være fullført innen 5-6 Hr, og for isolering av TEC i 8-10 timer. Isolasjon av DC og TEC undergrupper fra thymic vev er tid sensitive. Jo raskere isolasjonsprosedyren, jo bedre tilstanden til cellene. Endelig kan de isolerte celler benyttes for videre undersøkelser som sammenlignende studier av mRNA og protein ekspresjon, PCR-eksperimenter, protein isolert molekyl profilering (dvs. transcriptomics, mikro-RNA-analyse), samt cellekultur ^6..

Etikk Erklæring

For å kunne arbeide med menneske thymus vevet trenger forskeren å få godkjenning fra den lokale etikkutvalg eller ansvarlige myndigheter så vel som et informert skriftlig samtykke fra donor (eller vanligvis hans eller hennes foreldre, siden vevet er som regel hentet fra mindreårige barn). Videre bør alle menneskelige vev behandles som potensielt smittefarlige og passende tiltak bør iverksettes, for eksempel jobbe med hansker, etc.