Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

Der Thymus ist das Organ, in dem T-Zell-Entwicklung auftritt. Seine relative und absolute Größe mit dem Alter abnimmt, wenn sie teil sukzessive durch Fett ersetzt, obwohl Thymusaktivität noch im Alter festgestellt werden. Seine Bedeutung für die Immunantwort wurde in den frühen 1960er Jahren ^ein demonstriert.

Die T-Zell-Repertoire ist durch die Wechselwirkung der T-Zell-Rezeptoren, die mit Peptid-MHC-Komplexe auf unterschiedliche Arten von Thymus-APC, die das Überleben oder Tod Signale zu entwickelnden T-Zellen, was zu einer funktionellen und weitgehend selbst tolerant T-Zell-Repertoire ^{2 vorzusehen} geformt.

Etwa 98% der Zellen im menschlichen Thymus-T-Zellen entwickeln sich als Thymozyten bezeichnet. Die restlichen 2% bestehen aus einer Reihe von verschiedenen Zelltypen, einschließlich einer Vielzahl von TEC (kortikalen Mark, subkapsuläre), myeloide und plasmazytoiden DC (MDC, PDC), Makrophagen, B-Zellen reifen Umlauf-T-Zellen, Granulozyten, fibroblasts, Endothelzellen und Epithelzellen seltenen Zellen mit einem Expressions Phänotyp ähnlich derjenigen Zellen aus anderen Geweben, wie Muskel, Nervenzellen und respiratorischen Epithels (Abbildung 1). Davon TEC und DC sind die wichtigsten Arten von APC in einem normalen Thymus gefunden. In den letzten Jahren ist die Reinigung dieser APC-Typen für Kultur und molekularen Charakterisierung mehr und mehr an Bedeutung gewonnen. Aufgrund ihrer niedrigen Frequenz, Isolierung jeder dieser Zelltypen für eine detaillierte Analyse erfordert eine effiziente, reproduzierbare und kostengünstiges Verfahren. Die hier vorgestellte Methode ist eine Modifikation von bisher veröffentlichten Studien ^3,4.

Wie bei jedem anderen Gewebe können Zellgewinnung aus dem Thymus von enzymatisch Disaggregation der Zell-Zell-und Zell-Matrix-Interaktionsnetzwerke, um eine Suspension von Einzelzellen zu erhalten, erreicht werden. Es gibt bestimmte Parameter, wie gut Dissoziation Effizienz, Zellausbeute, die Lebensfähigkeit der Zellen und die Aufrechterhaltung des Zell surface Marker, die von entscheidender Bedeutung sind, und müssen für die erfolgreiche Isolierung dieser seltenen Zellpopulationen optimiert werden.

In diesem Protokoll wird Trennung von DC und TEC Teilmengen, indem eine Einzelzell-Suspension aus dem Gewebe durch mechanische Zerstörung und enzymatischen Verdau durchgeführt. Wir verwenden Collagenase aus Clostridium histolyticum A, die ein ausgewogenes Verhältnis von verschiedenen Enzymaktivitäten hat, um die native Kollagen, die das Gewebe zusammenhält brechen. DNase I in der Enzymlösung enthalten, um die Zellaggregation durch freie DNA von toten Zellen zu reduzieren (Thymozyten sind sehr empfindlich). Wir bieten auch einen alternativen Ansatz zu den typischen enzymatische Verdauung Gewebe mit mechanischen und enzymatischen Gewebebehandlung durch eine Gewebe Dissoziator unterstützt. Die Einzelzellsuspension wird dann in einer einzigen Percoll-Dichte-Zentrifugation zur Anreicherung der Fraktion mit niedriger Dichte (LDF) von Zellen unterzogen. Von diesem Teil der Zellen kann durch Färbung DC f isoliert werdenoder DC-Oberflächenmarker (dh CD11c ⁺⁾ und unter Verwendung magnetische Trennung oder Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS). Im Gegensatz zu den lymphoiden Zellen, die große Mehrheit der Zellen in der Thymusdrüse, nicht TEC nicht exprimieren CD45 auf hohem Niveau, jedoch sind positiv für das epitheliale Zelladhäsionsmolekül EpCAM. cTEC aus Mark TEC durch den Ausdruck eines noch nicht definierten Antigen durch die CDR-2 (kortikale dendritischen Retikulozyten-2)-Antikörper ^4,5 und etwas niedriger EpCAM-Expression erkannt unterschieden werden. Der Differenz Co-Expression von EpCAM und CDR2 ermöglicht die effiziente Isolierung dieser TEC Teilmengen über Hochgeschwindigkeits-Zellsortierung ^6.

Die hier vorgestellte Protokoll ist für den menschlichen Thymus-Gewebe optimiert. Die Dauer des Verfahrens hängt von der Menge des Gewebes und der Fähigkeit der Versuchs sowie der Geschwindigkeit des Zellsortierer, wenn FACS-Sortierung verwendet. Normalerweise kann das Protokoll für die Isolierung von DC in 5 abgeschlossen-6 H und für die Isolierung von TEC in 8-10 Std. Die Trennung von DC-und TEC Teilmengen aus Thymus-Gewebe ist an der Zeit empfindlich. Je schneller die Isolierungsverfahren, die besser der Zustand der Zellen. Schließlich können die isolierten Zellen für weitere Untersuchungen, wie Vergleichsstudien von mRNA und Proteinexpression, PCR-Experimente, Proteinisolierung, molekularen Charakterisierung (dh Transkriptom, Mikro-RNA-Analyse) als auch Zellkultur ⁶ verwendet werden.

Ethikerklärung

Um in der Lage, mit der menschlichen Thymusgewebe arbeiten muss der Forscher der Zustimmung der lokalen Ethikkommission oder zuständigen Behörden sowie eine fundierte schriftliche Zustimmung der Spender (oder in der Regel seine Eltern, zu erhalten, da Gewebe wird in der Regel von minderjährigen erhalten Kinder). Darüber hinaus sollten alle menschlichen Gewebe als potenziell infektiös und sollten geeignete Maßnahmen ergriffen werden, wie die Arbeit mit Handschuhen, etc. behandelt werden.