Designer nucleasen zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) kan worden gebruikt om het genoom van de muis implantatie embryo's wijzigt activeren zowel de homologe eind mee (NHEJ) en homologe recombinatie (HR) wegen. Deze voorschotten in staat de snelle generatie van muizen met precieze genetische modificaties.
Transgene muizen die site-specific genoom modificaties (knockout, knock-in) zijn van vitaal belang voor het ontleden van complexe biologische systemen als voor het modelleren van menselijke ziekten en het testen van therapeutische strategieën. Recente ontwikkelingen in het gebruik van designer nucleasen zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs), transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens), en geclusterde regelmatig afgewisseld korte palindromische herhalingen (CRISPR) /-CRISPR geassocieerde (CAS) 9 voor plaatsspecifieke specifieke genoom techniek opent de mogelijkheid om snelle en gerichte genoom modificatie uit te voeren in vrijwel elk laboratorium soorten zonder de noodzaak om vertrouwen op embryonale stamcellen (ES)-technologie. Een genoom bewerken proef begint typisch met identificatie van designer nuclease doelplaatsen binnen een gen van belang, gevolgd door constructie van custom DNA-bindende domeinen nuclease activiteit rechtstreeks aan de onderzoeker bepaalde genomische locus. Ontwerper nuclease plasmiden in vitro </ Em> getranscribeerd naar mRNA te genereren voor micro-injectie van bevruchte eicellen muis. Hier bieden we een protocol voor het bereiken van gerichte genoom wijziging door directe injectie van TALEN mRNA in bevruchte muis eicellen.
Muizen zijn veruit de meest populaire platform voor het genereren van transgene diermodellen. De veelzijdige toolbox voor genetische manipulatie van de muis embryo 1-3 is onlangs uitgebreid met genoom bewerken benaderingen op basis van designer nucleases zoals zink finger nucleases (ZFN) 4-6, transcriptie activator-achtige effector nucleases (TALEN) 7,8, en de geclusterde regelmatig afgewisseld korte palindromische herhalingen (CRISPR) /-CRISPR geassocieerd (CAS) 9 systeem 9. ZFN en TALEN functie als paren van twee speciaal ontworpen eiwit gebaseerde DNA-bindende domeinen (arrays van zinkvinger eiwitten en herhaalde variabele di-residuen (RVDS), respectievelijk) die elk zijn gekoppeld met de FokI endonuclease 10-12. Omgekeerd wordt de specificiteit van Cas9-gemedieerde DNA-splitsing door transactiverende CRISPR RNA (crRNA en tracrRNA, die ook kunnen worden gecombineerd tot een enkel chimeer RNA-molecuul aangeduid lijst RNA) 11 die elk een complex met deCRISPR eiwit.
Talens met een gedefinieerde opeenvolging van RVDS kan snel worden gebouwd door individuele onderzoekers met een veelheid van vergadering strategieën te kiezen 13-17. CRISPR/Cas9 belooft nog minder arbeidsintensieve productie van designer nucleasen, maar de specificiteit van de geleider RNA-DNA-binding nog niet volledig opgelost 18,19. Generatie van aangepaste ZFNs is tot nu toe beperkt tot gespecialiseerde academische laboratoria en commerciële leveranciers zoals Sangamo Biosciences en de Sigma CompoZr service.
In het algemeen genoom bewerken met designer nucleases wordt beoogd dubbele breuken (DSB) op bepaalde genomische loci, die vervolgens aan te trekken niet-homologe eind mee (NHEJ) of homologe recombinatie (HR) DNA-reparatie machines 10,12. NHEJ gemedieerde reparatie van DSB resulteert vaak in de inleiding van inserties en deleties in de nabijheid van de plaats van reparatie. Zo NHEJ reparatie ceen worden benut voor het uitspelen van de functie van een target-gen door de invoering van een frame-shift mutatie in de genen-eiwit coderende sequentie 4,7,9. Alternatief kan gedefinieerd toevoeging of vervanging van genetische informatie worden bereikt door een DNA-donor samen met de ontwerper nucleasen. Een DNA donor omvat onderzoekers ontworpen DNA-sequenties geflankeerd door gebieden met homologie met de doelwitlocus, dus dienen als een sjabloon voor DSB reparatie door HR. Beide plasmiden 5,6,20 en enkelstrengs oligonucleotiden 8,9,21 zijn met succes gebruikt als donor. Noch NHEJ-nor-HR gemedieerde genoom bewerkt moeten de introductie van een selecteerbare merker in het genoom van de muis embryo, dat deze strategieën bijzonder geschikt voor het maken van kleine veranderingen in de nucleotidesequentie zonder de totale genetische architectuur maakt.
In dit protocol beschrijven we alle essentiële voorwaarden voor genoom bewerken in demuis embryo met behulp van Talens. Deze omvatten 1) identificatie van een TALEN target site 22, 2) bouw van Talens door gouden poort klonen 13, 3) in vitro synthese van TALEN mRNA, 4) micro-injectie van TALEN mRNA in bevruchte muis eicellen, 5) chirurgische procedures voor de embryo transfer en 6) analyseren van TALEN geïnduceerde mutagenese in grondlegger dieren. Wij richten ons op TALEN mRNA micro-injectie en screening van oprichters voor NHEJ-geïnduceerde inserties / deleties. Hiervoor hebben we bifunctionele TALEN constructen die zowel expressie in zoogdiercellen uitgevoerd wanneer getransfecteerde plasmiden en in vitro synthese van TALEN mRNA voor micro-injectie in muisembryo's gegenereerd. Deze constructen omvatten een afgeknotte TALE ruggengraat 23 gefuseerd heterodimere FokI domeinen 24,25 optimale genoom bewerking in zoogdiercellen. Dit protocol kan ook voor micro-injectie van andere designer nucleasen of gecombineerde injecties van ontwerper nucleases worden aangenomenen donor constructies (ontwerp van DNA donoren is in uitstekende technische publicaties beschreven door Wefers et al.. 26,27).
Ethische verklaring
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften van de Kantonnale Veterinair Bureau van het kanton Zürich.
Designer-nuclease gedreven genoom bewerken benaderingen zijn aanzienlijk uitgebreid het aantal soorten vatbaar zijn voor gerichte aanpassingen van hun respectieve genomen 10,12. Bij muizen, heeft-gen-targeting in ES-cellen een standaard techniek voor meer dan twee decennia; echter is het moeilijk aan te passen ES cellen uit andere soorten dan de muis aangetoond, hoewel er recente succes in ratten ES-cellen is. Zelfs met de beschikbaarheid van "off-the-shelf"-gen gerichte muis ES-cel klonen die door consortia, zoals EUCOMM, KOMP of NorCOMM 3 genoom uitgeven door ZFN en TALEN biedt een hogere precisie en flexibiliteit met betrekking tot het spectrum van aanpassingen die kunnen worden ingebracht in het muis genoom. Oprichter dieren dragen nuclease gemedieerde mutaties lijken sterk kiem-lijn bevoegde 4-6,20,21, wat niet altijd het geval voor chimaera afkomstig van blastocyst injecties van ES-cellen zijn. In bepaalde gevallen micro-injectie van designer nucleases kan resulteren in aanzienlijk sneller genereren van nieuwe muis lijnen met gerichte genoom wijzigingen.
De succesvolle productie van knockout muizen door injectie van ZFN TALEN en hangt in grote mate af van de activiteit van de geïnjecteerde nuclease paar. Talens is aangetoond dat een hoog slagingspercentage hebben gericht op een groot aantal genen in verschillende organismen; Echter, recente studies suggereren dat TALEN binding gevoelig is voor cytosine methylering 30,31. dus nieuw gegenereerde nuclease paren, bijvoorbeeld Talens gekloneerd in pCAG T7-vectoren kunnen worden transiënt getransfecteerd in een muizen cellijn zoals NIH-3T3 of Neuro -2a, die chromatine stand van de muis embryo nabootsen enigszins. Hier kunnen nucleaseactiviteit worden geschat met behulp van de T7 endonuclease assay of een restrictiedigest van PCR-product zoals beschreven in paragraaf 5 voorafgaand aan mRNA-synthese en micro-injectie. Wij raden sequencing van het genoom regio van belang in het respective cellijn en de muis stam gebruikt voor micro-injectie experimenten.
In muis zygoten zullen verschillende TALEN of ZFN paren optimaal werken bij verschillende mRNA-concentraties en bijgevolg de optimale werking concentratie van de micro-injectie nuclease mRNA wellicht proefondervindelijk worden bepaald. Afhankelijk van de nuclease pair, zal een te lage concentratie resulteren in geen decollete terwijl een te hoog kan leiden tot embryo letaliteit. Afhankelijk van de nuclease paar, hebben we succes gehad met totale concentraties zo laag als 2 ng / ul en zo hoog als 200 ug / ul mRNA. Deze effecten zijn moeilijk te voorspellen uit experimenten in celkweek en de concentratie nuclease optimaal voor zowel embryo overleving en modificatieverhouding van de doelwitlocus moet empirisch worden bepaald.
Zeer actieve ZFN of TALEN kunnen hun doelsequentie aanhangen dan de een-cel stadium van de gemicroinjecteerd embryo en dus leiden tot complexe patronen van mutagenese eend mozaïcisme in oprichters. Wij en anderen 4 hebben drie of meer verschillende gemuteerde allelen in een oprichter (figuur 5C) waargenomen. Dus, als de oprichting van een nieuwe muis lijn van deze oprichters, nakomelingen zorgvuldig worden gescreend door sequencing op de aanwezigheid van de gunstige mutatie sinds de spijsvertering testen leveren bewijs alleen dat een ongedefinieerde mutatie aanwezig is.
Een kritiek gehoorde tegen ZFN en TALEN systemen is de mogelijkheid dat deze nucleasen ook in staat splitsen sequenties die ergens anders in het genoom die vergelijkbaar is met de doelplaatsen zijn. Dergelijke off-target effecten zijn waargenomen met de vroege generatie reagentia met de homodimere FokI domein en heterodimer constructen werden ontworpen om off-target effecten 25 verlichten. Potentiële off-target sites kunnen worden voorspeld tot op zekere hoogte in silico 32,33 en gescreend door PCR en sequencing. Een duidelijk voordeel of behulp ZFNs en Talens voor het genereren van muizen in plaats van cellijnen is de mogelijkheid van het verwijderen van de palen mutaties gekoppelde gewenste genoom wijziging door het uitvoeren van verscheidene terugkruisingen naar een wild-type stam keuze. Voor de analyse van een groot aantal oprichter muizen volgende generatie diepe sequencing van PCR-producten gegenereerd uit de nuclease gerichte locus en in silico voorspelde off-target loci kan een alternatieve kwalitatieve en kwantitatieve uitlezing bieden om de destructie analyses van PCR-producten.
De kunstmatige voortplantingstechnieken beschreven in dit protocol zijn geoptimaliseerd voor standaard muis stammen gebruikt voor micro-injectie experimenten zoals C57BL/6J of B6D2F1. Muizen van verschillende oorsprong, zoals outbred stammen, kan in principe worden gebruikt voor het genoom bewerken benaderingen en wellicht een meer geschikte genetische achtergrond voor specifieke onderzoeksvragen te bieden. De prestaties van geassisteerde voortplantingstechnieken zoals superovulatie kan predi zijncted een aantal stammen 34-36 maar kan verdere optimalisatie van afwijkende stammen verlangen bij een voldoende aantal embryo's te verkrijgen voor nuclease micro-injectie.
Naast ZFN en TALEN, hebben nieuwe designer nucleases zoals de RNA-begeleide CRISPR/Cas9 systeem 9,37,38 nu ingevoerd voor genoom toepassingen voor het bewerken. Alle methodes voor micro-injectie en analyse van oprichter dieren die hier worden beschreven zijn ook van toepassing op CRISPR/Cas9 en toekomstige vormen van genoom bewerken.
The authors have nothing to disclose.
Wij willen Monika Tarnowska, Cornelia Albrecht, en Ewa Skoczylas bedanken voor een uitstekende technische bijstand. Deze studie werd gefinancierd door SNF Sinergia subsidie CRSI33-125073 naar PP.
BsaI | NEB | R0535S or L |
Esp3I | Thermo Scientific | ER0451 |
T4 Ligase | NEB | M0202S or L |
Spectinomycin | Sigma | S0692-1ML |
Ampicillin | Sigma | A0166 |
X-Gal | Sigma | B4252 |
IPTG | Sigma | I6758 |
Plasmid-Safe nuclease | Epicentre | E3101K |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 |
QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 |
mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit | Invitrogen | AM1345 |
NucAway Spin Columns | Invitrogen | AM10070 |
RNaseZAP | Sigma | R2020-250ML |
NorthernMax Formaldyde Load Dye | Invitrogen | AM8552 |
RNA Millennium Markers | Invitrogen | AM7150 |
10x TBE buffer | Thermo Scientific | B52 |
T7 endonuclease | NEB | M0302S or L |
pGEM-T EasyVector System I | Promega | A3600 |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain | Invitrogen | S-7563 |
pregnant mare's serum gonadotrophin (PMSG) | Sigma | G4877 |
human chorionic gonadotropin (hCG) | Sigma | CG5 |
M2 embryo culture medium | Sigma | M7167 |
M16 embryo culture medium | Sigma | M7292 |
Mineral oil, embryo tested | Sigma | M8410 |
Ketamine | CentraVet | Ket 201 |
Xylazine | Sigma Aldrich | 46995 |
Equipment/Tools | ||
Inverted microscope with Nomarski DIC optics (for example Nikon Eclipse TE200) | Nikon | |
Micromanipulator units (for example Narishige, NT88NF) | Narishige | |
Embryo holding capillaries | Sutter instruments | B100-75-10 |
Embryo injection capillaries | Narishige | GD-1 |
Capillary puller (for example Sutter P97) | Sutter instruments | |
Microforge (for example Narishige MF-900) | Narishige | |
Walton skin scissors | FST | 14077-10 |
Surgical scissors | FST | 14041-10 |
Surgical probe | FST | 10140-03 |
Reflex wound clip system (9mm) | FST | 12031-09 |
Reflex wound clips (9mm) | FST | 12032-09 |
Dumont fine forceps 5 | FST | 11254-20 |
Moria curvrd forceps | FST | 11370-31 |
Moria fine forceps | FST | 11399-80 |
Dietrich bulldog clamp | FST | 18038-45 |
Animals | ||
C57BL/6J mice | Jackson labs | strain code 000664 |
CD-1 mice | Charles river | strain code 000664 |