Summary

Микрофлюидных На чипе Захват-циклоприсоединения Реакция на Обратимо Остановите малых молекул или многокомпонентные структуры для биосенсора приложений

Published: September 23, 2013
doi:

Summary

Мы представляем метод для быстрого, обратимые иммобилизации малых молекул и функционализованных ансамблей наночастиц для поверхностного плазмонного резонанса (SPR) исследований, с помощью последовательного на-чипе bioorthogonal химия циклоприсоединение и антитело-антиген захвата.

Abstract

Методы быстрого поверхности иммобилизации биологически активных малых молекул с контролем над ориентации и плотности иммобилизации весьма желательны для биосенсора и микрочипов приложений. В этом исследовании, мы используем высокоэффективную ковалентную bioorthogonal [4 +2] циклоприсоединения реакции между транс-циклооктена (TCO) и 1,2,4,5-тетразин (TZ) для того, чтобы микрофлюидных иммобилизации TCO / Tz-производные молекул . Мы контролировать процесс в режиме реального времени в условиях непрерывного потока с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Чтобы включить обратимой иммобилизации и продлить экспериментальный спектр поверхности датчика, совместить нековалентная антиген-антитело компонент захвата с реакцией циклоприсоединения. По поочередно представляя TCO или TZ фрагменты на поверхность датчика, несколько процессов захвата-циклоприсоединения в настоящее время возможно только на одной поверхности датчика для на чипе сборки и взаимодействия исследований различных многокомпонентных конструкций. Мы яllustrate этот метод с двух различных экспериментах иммобилизации на чипе биосенсора; небольшой молекулы, AP1497, который связывается FK506-связывающий белок (12 FKBP12) и той же небольшой молекулы, как часть иммобилизованным на месте и функциональными наночастицы.

Introduction

Эффективные реакции сопряжения являются ценными инструментами для крепления биоактивные молекулы на поверхности для различных биотехнологических приложений. В последнее время очень быстро bioorthogonal [4 +2] циклоприсоединения между транс-циклооктена (TCO) и 1,2,4,5-тетразин (Tz) был использован для обозначения поверхности клеток, субклеточных структур, антитела и наночастиц 1. – 7 Здесь мы используем реакцию [4 +2] циклоприсоединения в сочетании с захватом антигена / антитела (GST / анти-GST) для обратимого на-чипе синтеза многокомпонентных структур для поверхностного плазмонного резонанса (SPR) анализа взаимодействия и мониторинга Процесс в режиме реального времени (рис. 1). 8,9 Примечательно, что стратегия захвата-циклоприсоединения позволяет регенерацию поверхности с помощью установленным протоколом. 8 Как следствие, собраний стабильных поверхностей датчиков с контроля над лиганда ориентации и плотности для различных нового анализа Форматы теперь это возможно. Использованиеэта стратегия мы демонстрируем иммобилизации TCO / Tz-производные малых молекул и характеризуют темпы циклоприсоединения в различных условиях буфера. Мы выбрали известную взаимодействие между FKBP12 и AP1497 молекулы, который связывает FKBP12 10-12 в качестве примера для проверки того, что стратегия захвата-циклоприсоединения сохраняет способность малых молекул взаимодействовать с своей цели, когда либо непосредственно связанными с иммобилизованными GST антигенов или иммобилизованных наночастиц (NPS).

Этот метод имеет несколько преимуществ. Во-первых, обратимы иммобилизация малых молекул на сенсорных чипов теперь это возможно. Во-вторых, TCO / Tz иммобилизация малых молекул также позволяет этикеток без исследования взаимодействия, призванным устранить ориентацию канонических SPR исследований, и может обеспечить дополнительную вид обязательного взаимодействия. В-третьих, этот метод позволяет микрофлюидных синтез целевых наночастиц и немедленной оценки их bindinг свойствами. Это обещает повысить эффективность оценки или скрининга целевых наночастиц, а также уменьшить количество необходимых наночастиц. 13-15 В-четвертых, этот подход может измерять кинетики реакции из bioorthogonal реакций циклоприсоединения в реальном времени при непрерывном потоке. Наконец, иммобилизация химии TCO / Tz является надежной в присутствии сыворотки. Взятые вместе, мы ожидаем, что этот универсальный подход широко облегчить строительство стабильных поверхностей датчиков для широкого спектра микрофлюидных исследований, имеющих отношение к в пробирке и в естественных клеточных приложений.

Protocol

1. Подготовка GST и наночастиц (NP) конъюгатов Подготовка GST-ТШО: Добавить 8 мкл раствора NHS-TCO (50 мМ в ДМСО) к 100 мкл GST (1 мг / мл в PBS) и встряхивают смесь при комнатной температуре в течение 1 часа. Удалить избыток реагента с использованием колонки спин обессоливания Zeba. Извлеченн…

Representative Results

Данные и цифры были адаптированы из работы 8. Эффективное обратимым иммобилизация биологически активных малых молекул с контролем над ориентации и плотности играет ключевую роль в разработке новых приложений биосенсора. Используя быстрый bioorthogonal реакции между ТШО и Tz, …

Discussion

Метод захвата-циклоприсоединения описано здесь позволяет быстро, обратимые иммобилизации модифицированных наночастиц и малых молекул для чипа на основе взаимодействия без наклеек и кинетических исследований. Протокол иммобилизации может быть выполнена в течение нескольких минут, ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы признаем, финансирование из NIH (NHLBI Договор № HHSN268201000044C чтобы RW, SH и SYS).

Materials

Reagent
Sensor Chip CM5 GE Healthcare BR-1005-30
Amine coupling kit GE Healthcare BR-1000-50
GST capture kit GE Healthcare BR-1002-23
NAP-10 Columns GE Healthcare 17-0854-01
GST, lyophilized in 1X PBS Genscript Z02039 1 mg/ml
rhFKBP12 R&D Systems 3777-FK
Surfactant P-20 GE Healthcare BR-1000-54
Glycine 2.0 GE Healthcare BR-1003-55
Zeba spin desalting column Thermo 89882 7 K MWCO
Amicon Ultra 4 Fisher UFC810096 100 K centrifugal filter
TCO-OH Ref. 8 Synthesized in-house
TCO-NHS Ref. 8 Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25
Tz-BnNH2 Ref. 8 Synthesized in-house
Tz-NHS Ref. 8 764701 Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701
NP-NH2 = CLIO-NH2 Ref. 8 Synthesized in-house
AP1497, AP1497-Tz Ref. 8 Synthesized in-house
Equipment
SPR Biosensor GE Healthcare Biacore T100

References

  1. Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
  2. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
  3. Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
  4. Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
  5. Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
  6. Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
  7. Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
  8. Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
  9. Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
  10. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
  11. Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
  12. Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
  13. Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
  14. Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
  15. Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
  16. Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
  17. Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
  18. Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
  19. Mammen, M., Choi, S. -. K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
  20. Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
  21. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
  22. Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
  23. Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
  24. GE Healthcare. . Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , (2005).

Play Video

Cite This Article
Tassa, C., Liong, M., Hilderbrand, S., Sandler, J. E., Reiner, T., Keliher, E. J., Weissleder, R., Shaw, S. Y. Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications. J. Vis. Exp. (79), e50772, doi:10.3791/50772 (2013).

View Video