Summary

Выделение и Th17 дифференцировки наивных CD4 Т-лимфоцитов

Published: September 26, 2013
doi:

Summary

С эффекторных функций, отличных от других клеточных подмножеств Т, клетки Th17 были централизованно вовлечен в воспалительный аутоиммунными. Это пробирке протокол в Th17 дифференциация предоставляет средства для определения, является ли наивные CD4 + Т-лимфоциты могут дифференцироваться в клеток Th17, и для дальнейшего изучения их роли в аутоиммунных и ответа хозяина.

Abstract

Th17 клетки особым подмножество Т-клеток, как было обнаружено, продуцируют интерлейкин 17 (IL-17), и отличаются в зависимости от других клеточных подмножеств т с Th1, Th2 и регуляторных Т-клеток. Клетки Th17 появились в качестве центрального виновника в переусердствовать воспалительных иммунных реакций, связанных с многих аутоиммунных расстройств. В этом методе мы очистить Т-лимфоцитов из селезенки и лимфатических узлов мышей C57BL / 6, а также стимулировать очищенные CD4 + Т-клеток под контролем и Th17-индуцирующих средах. Th17-индуцирующей среда включает в себя стимуляцию в присутствии анти-CD3 и анти-CD28 антителами, IL-6 и TGF-β. После инкубации в течение по крайней мере 72 часов и на срок до пяти дней при 37 ° С, клетки затем анализировали на способность производить IL-17 через проточной цитометрии, КПЦР и ИФА. Th17 дифференцированными CD4 + CD25-Т-клетки могут быть использованы для дальнейшего выяснения роли, что Th17-клетки играют в возникновении и прогрессировании аутоиммунных и принимающей деFense. Кроме того, Th17 дифференциация CD4 + CD25-лимфоцитов из различных моделей мышей нокаутом / болезни может способствовать нашему пониманию клеточных судеб пластичности.

Introduction

CD4 + Т-лимфоциты (Т-клетки) играют важнейшую роль в иммунной системы опосредованного защиты от инфекционных микроорганизмов. С другой стороны, Т-клетки также тесно связана с наступлением и развитием аутоиммунных заболеваний, таких как диабет типа 1, системная красная волчанка и ревматоидный артрит. CD4 + Т-лимфоциты активируются путем сочетания Т-клеточного рецептора (TCR) взаимодействия с антигеном / главного комплекса гистосовместимости II (MHCII) молекул, а также взаимодействия рецепторов CD28 с B7.1/B7.2 лигандами 15. В дополнение к предоставлению TCR стимуляции и CD28 совместной стимуляции, антиген-представляющих клеток также обеспечивают цитокинов среды, которая определяет дифференциации состояние Т-лимфоцит, тем самым направляя реакцию Т-лимфоцитов в к данному антигену. Отдельное патоген / антиген-представляющих клеток взаимодействия создают различных средах цитокинов, которые исказить Т-лимфоцитов вниз различные пути, направленные на Элиной подсветкой инициирующего патогена. К сожалению, T-лимфоцитов эффекторные пути, первоначально направленные на искоренение вторжение болезнетворных микроорганизмов, может быть ошибочно направлена ​​против самостоятельной тканей 15. Таким образом, более глубокое понимание состояния дифференцировки каждого отдельного CD4 + Т-клеток подмножество имеет решающее значение для нашего понимания того, как модулировать баланс между уничтожения патогенных и терпимости к себе.

В дополнение к Th1, Th2, и индуцируемой клеточной дифференцировки путей регуляторных Т, наивные Т-лимфоциты также может приводиться в действие цитокинов вниз по пути Th17. В то время как Th1 клеток боевых внутриклеточных патогенов, Th2 клетки устранить внеклеточных патогенов, и регуляторные Т-клетки (Tregs) минимизировать воспалительные реакции 1, 16; Th17-клетки играют важную роль в ликвидации внеклеточных бактерий и грибков. Th17 клетки обычно обозначается экспрессии специфических клонов фактора транскрипции RORγT и производства IL-17A, который способствует активации макрофагов и нейтрофилов 1, 7.

Th17 клетки были вовлечены в нескольких аутоиммунных заболеваний, а также связанные с ними модели на грызунах. Например, было продемонстрировано, что IL-23 (который необходим для поддержания фенотип Th17), но не IL-12, был центральной преступник в экспериментальном аутоиммунном энцефалите (ЭАЭ), модель болезни грызунов для MS. Это впоследствии было показано, что снижение производства IL-17 коррелирует с предотвращением EAE 2, 6, 17. Кроме того, клетки Th17 были связаны с другими аутоиммунными нарушениями, включая артрит и системная красная волчанка (СКВ) 10, 16. IL-23 дефицитных p19 – / – мышей было показано, имеют очень низкие количества клеток Th17, и устойчивы к развитию не только EAE, но и коллаген-индуцированного артрита, модели ревматоидного артрита 10, 18. Кроме того, мыши, получавшие нейтрализации IL-17A антитела кормеэ начало коллаген-индуцированного артрита были также установлено, что разрешение повреждения суставов 18. Следует отметить, что роль клеток Th17 в прогрессировании аутоиммунных заболеваний остается охарактеризовать как недавние исследования также показали защитную роль Th17-клеток в диабетом типа 1 9, 11 и воспаление кишечника 14. Эти исследования подтверждают важность Th17 дифференциации в аутоиммунными.

В пробирке дифференциации Th17 является необходимым методом в исследовании Т-клеток, потому что есть по крайней мере два трудных вопросов, которые требуют дальнейшего изучения: 1) Как именно ИЛ-6 регулируют баланс между Treg и Th17 дифференциации, и 2) каковы точные механизмы за Ил-17-индуцированной воспалительных заболеваний? Наша методика использует CD4 + CD25-Т-клеток из селезенки и лимфатических узлов C57BL / 6 мыши. Важно отметить, что хотя можно индуцировать дифференцировку Th17 с помощью нечистойнаселение, приобретая по крайней мере, 80% чистого CD4 + CD25-Т-клеток населения сводит на нет любое беспокойство загрязнения и обеспечивает более успешные результаты Th17 дифференциации. Для того чтобы достичь надлежащего дифференцировку Th17, CD4 + CD25-Т-клетки инкубировали в присутствии анти-CD3 и анти-CD28, которые обеспечивают сигналы активации, 1 и 2, соответственно, и IL-6, и TGF-β. Хотя сообщалось, что IL-23 только может быть использована для достижения Th17 дифференциацию, позднее было показано, что IL-23 является необходимым для стабильности клеточной популяции Th17, но IL-6 и TGF-β имеют важное значение для дифференциации Th17 3, 18, ​​19. Мышиные исследования показали, что рецептор IL-23 экспрессируется на CD4 + Т-клеток только после их стимулировали IL-6 и TGF-β 13, 18. Кроме того, клетки Th17 будет успешно развиваться в присутствии IL-23-антитела блокируют до тех пор, IL-6 и TGF-β присутствуют 18, 19. Таким образом, этот протокол пров Th17 дифференциацияIDES соответствующие условия для успешного вызвать Th17 дифференциации. Развитие лучшего понимания механизмов, лежащих Th17 дифференциации и IL-17 производства представить возможность для разработки более совершенных терапии, направленных на аутоиммунными нарушениями 13.

Protocol

Любое использование животных было проведено в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по Уходу за животными и использования. 1. Приготовления смесей и СМИ Стерильная PBS рН: 7.3 (1 л) 0,23 г NaH 2 PO 4 1,15 г Na 2 HPO 4 <br /…

Representative Results

Этот протокол дифференциация Th17 начинается с удаления селезенки и подмышечных, плечевых, мезентериальных, шейки матки, и паховых лимфатических узлов. Представление из мест каждого можно найти на рисунках 2 и 3. На рисунках 1 и 5 и дают наглядное представление и…

Discussion

Здесь мы описали протокол для достижения в пробирке Th17 дифференциации. Изучение Th17 дифференциации важно, так как дифференциация Т-лимфоцитов в подгруппе Th17 имеет решающее значение для эффективной ликвидации человеческих патогенов 13. И наоборот, IL17 производство было связан?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа частично поддержана на NIH / NCATS клинических и трансляционных науки Awards в Университете Флориды TL1 TR000066 и UL1 TR000064, разнообразие дополнения от родителей Грант R01AI056152 из Национального института здравоохранения, гранта реагента BD Biosciences и университета Флориды.

Materials

Reagent/Material
Sterile Polyestrene Petri Dish Fisher Scientific 0875713A 60 mm x 15 mm
autoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Premium Microscope Slides, Frosted Fisher Scientific 12-544-3 3″ x 1″1 mm
5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle BD Biosciences 309632
Corning 15 ml Centrifuge Tubes Sigma-Aldrich CLS430791
Nylon 40 microns Miami Aquaculture Nylon 40/26
Microtest tissue culture plate 96 well U bottom BD Biosciences 35-3077
Corning Costar 24 well cell culture plates Sigma-Aldrich CL3524
Eppendorf Tubes 1.5 ml Fisher Scientific 05-408-129
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e BD Biosciences 553057
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 BD Biosciences 553294
Mouse IL-6 Recombinant Protein eBioscience 14-8061-62
TGFbeta R&D Systems 240-B-002
Trypan blue solution 0.4 % Sigma-Aldrich 66H2364
Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 BD Biosciences 558107
APC Rat Anti-Mouse CD8a BD Biosciences 553035
PE Conjugated Anti-mouse CD25 eBioscience E01155-516
Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 BD Biosciences 560820
Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse BD Biosciences 51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse Miltenyi Biotec 130-091-221
ABAM Cellgro 30-004-CI
RPMI Corning, Cellgro 10-040-CM
B 2-MercaptoEthanol MP Biomedical 194834 Hazardous
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)
Ionomycin Calcium Salt Sigma-Aldrich 13909-1ML Hazardous
Brefeldin A (BFA) MP Biomedicals 159027
ELISA IL-17A Capture mAb BD Biosciences 555068
ELISA IL-17A Detection mAb BD Biosciences 555067
ELISA IL-17A Standard eBioscience 14-8171-80
IL-2 ELISA Kit BD Biosciences 555148
TMB Substrate Reagent Set BD Biosciences 555214
Equipment
autoMACS Pro Cell Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
Sorvall Legend RT+ Centrifuge ThermoScientific
Napco series 8000 WJ CO2 Incubator ThermoScientific
PTC-200 Peltier Thermal Cycler Biorad

References

  1. Chen, Z., Lin, F., et al. Foxp3 and RORγT: transcriptional regulation of Treg and Th17. International Immunopharmacology. 11, 536-542 (2011).
  2. Cua, D. J., Sherlock, J., et al. Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain. Nature. 421, 742-748 (2003).
  3. El-Behi, M., Rostami, A., et al. Current views on the roles of Th17 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalitis. J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
  4. Inaba, K., Kroide, S., et al. Properties of memory T lymphocytes isolated from the mixed leukocyte reaction. Proc Natl Acad Sci. 82, 7686-7690 (1985).
  5. L, I. v. a. n. o. v. F. r. u. t. o. s. R., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 16, 337-349 (2008).
  6. Jager, L. D., Dabelic, R., et al. The Kinase Inhibitory Region of SOCS-1 is Sufficient to Inhibit T helper-17 Function in Experimental Allergic Encephalomyelitis. J. Neuroimmunol. 232, 08-18 (2011).
  7. Kimura, A., Kishimoto, T. IL-6: regulator of Treg/Th17 balance. Eur. J. Immunol. 40, 1830-1835 (2010).
  8. Korn, T., Bettelli, E., et al. IL-17 and Th17 Cells. Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).
  9. Kriegel, M. A., Seflk, E., et al. Naturally transmitted segmented filamentous bacteria segregate with diabetes protection in nonobese diabetic mice. PNAS. 108, 11548-11553 (2011).
  10. Langrish, C. L., Chen, Y., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. J. Exp. Med. 201, 233-240 (2005).
  11. Lau, K., Benitez, P., et al. Inhibition of type 1 diabetes by a Lactobacillus johnsonii mediated Th17 bias. J. Immunol. 186, 3538-3546 (2011).
  12. Lee, Y., Awasthi, A., et al. Induction and molecular signature of pathogenic TH17 cells. Nat Immunol. 13, 991-999 (2012).
  13. Litmann, D. R., Rudensky, A. Y. Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation. Cell. 140, 845-858 (2010).
  14. O’Connor, W., Kamanaka, M., et al. A protective function for interleukin 17A in T cell-mediated intestinal inflammation. Nat Immunol. 10, 603-609 (2009).
  15. Picca, C. C., Larkin, J., et al. Role of TCR specificity in CD4+CD25+ regulatory T cell selection. Immunol Rev. 212, 74-85 (2006).
  16. Shah, K., Lee, W. W., et al. Disregulated balance of Th17 and Th1 cells in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research & Therapy. 12, R53 (2010).
  17. Sospedra, M., Martin, R. Immunology of Multiple Sclerosis. Annu. Rev. Immunol. 23, 683-747 (2005).
  18. Stockringer, B., Veldhoen, M. Differentiation and function of Th17 T cells. Current Opinion in Immunology. 19, 281-286 (2007).
  19. Veldhoen, M., Hocking, R. J., et al. TGFβ in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells. Immunity. 24, 179-189 (2006).
  20. Zou, Y., Zhang, H., et al. Strain-dependent production of interleukin-17/interferon-γ and matrix remodeling-associated genes in experimental Candida albicans keratitis. Mol Vis. 18, 1215-1225 (2012).

Play Video

Cite This Article
Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin III, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naïve CD4 T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (79), e50765, doi:10.3791/50765 (2013).

View Video