Summary

Totaal Eiwitextractie en 2-D gelelektroforese Werkwijzen voor<em> Burkholderia</em> Soorten

Published: October 15, 2013
doi:

Summary

De leden van het Burkholderia geslacht zijn ziekteverwekkers van klinisch belang. We beschrijven een werkwijze voor het totaal bacterieel eiwit extractie met mechanische verbreking en 2-D gelelektroforese voor daaropvolgende proteoomanalyse.

Abstract

Het onderzoek naar de intracellulaire eiwit niveaus van bacteriële species van belang voor het begrip van de pathogene mechanismen van ziekten veroorzaakt door deze organismen. Hier beschrijven we een werkwijze voor eiwitextractie uit Burkholderia species gebaseerd op mechanische lysis gebruik van glazen kralen in aanwezigheid van ethyleendiaminetetra-azijnzuur en fenylmethylsulfonylfluoride in met fosfaat gebufferde zoutoplossing. Deze methode kan worden gebruikt voor verschillende soorten Burkholderia, voor verschillende groeiomstandigheden en het is waarschijnlijk geschikt voor gebruik in proteomische studies van andere bacteriën. Na eiwitextractie, is een twee-dimensionale (2-D) gelelektroforese proteomics techniek beschreven mondiale veranderingen studeren in de proteomen van deze organismen. Deze werkwijze bestaat uit de scheiding van eiwitten naar hun iso-elektrisch punt van iso-elektrische focussering in de eerste dimensie, gevolgd door scheiding op basis van molecuulgewichtdoor acrylamide gelelektroforese in de tweede dimensie. Visualisatie van gescheiden eiwitten wordt uitgevoerd door zilverkleuring uitgevoerd.

Introduction

Het geslacht Burkholderia bestaat uit meer dan 62 soorten, Gram-negatieve organismen geïsoleerd uit een breed scala van niches, en is verdeeld in twee clusters 1,2. De eerste cluster omvat mens, dier en phytotrophic organismen, en de meeste studies hebben zich gericht op de pathogene soorten van deze groep vanwege hun klinisch belang. De meeste pathogene leden zijn B. pseudomallei en B. mallei (die melioïdose en kwade droes respectievelijk veroorzaakt) 3,4 en opportunistische pathogenen (de 17 gedefinieerde soorten van het Burkholderia cepacia complex, BCC) 5, die ziekte bij cystic fibrosis (CF) en chronische granulomateuze ziekte (CGD) veroorzaken 1. De tweede cluster met meer dan 30 niet-pathogene species omvat bacteriën geassocieerd met planten of met de omgeving, en worden beschouwd als potentieel gunstig voor de gastheer 2.

Talrijke complicaties ontstaan ​​frOM bacteriële infectie met pathogene leden van het genus Burkholderia, zoals overdracht van het pathogeen tussen patiënten, verspreiding van de ziekte en het falen van de behandeling vanwege de intrinsieke of verworven resistentie tegen antibiotica die hardnekkig in de meeste gevallen 6-9. Derhalve verkrijgen van een beter begrip van de basis voor vaststelling van bacteriële infecties is essentieel voor de behandeling van ziekten veroorzaakt door deze organismen. Om inzicht te krijgen in de totstandkoming van de infectie te krijgen, zijn uitgebreide onderzoek naar de bacteriële componenten in verband met pathogenese nodig. Studies gericht op de proteomics analyse van Burkholderia organismen met behulp van proteomics methoden beschreven eiwitten die zijn betrokken bij bacteriële pathogenese alsook veranderingen in hun proteoom profielen 10-16.

Eiwit extractiemethoden middels sonicatie en bevroren en ontdooid cycli lysisbuffer die hoge concentration van ureum, heeft thiourea in combinatie met een schoonmaakmiddel en amfolyten toegepast in Burkholderia proteomics studies 10-13. Hoewel ureum is zeer efficiënt voor eiwitdenaturatie kan een evenwicht te bereiken in waterige oplossing met ammonium-isocyanaat, die kunnen reageren met aminozuurgroepen, onder vorming van artefacten (carbamylering reactie) 17. Daarom wordt aanbevolen drager amfolyten, die als cyanaat vangers omvatten en temperaturen boven 37 ° C 17 voorkomen. Bovendien, elke chemische interferentie lysisbuffer met eiwitten kwantificering voorkomen, dezelfde lysisbuffer kan worden gebruikt om de standaardkromme te genereren zodat de monsters en standaarden hebben dezelfde achtergrond 10. Andere methoden omvatten het gebruik van alkalische buffers en wasmiddelen met warmte incubatieperiode 17,18, maar deze voorwaarden kunnen veranderingen in het proteoom induceren en sommige wasmiddelen zijn niet compatibel met proteomics aanvraag, tenzij latere detergensverwijdering stappen zijn inbegrepen 17,18.

Na voldoende extractie en kwantificering kunnen globale eiwitexpressie van elk individueel eiwit worden onderzocht door proteoomanalyses zoals twee-dimensionale (2-D) gelelektroforese. Deze techniek werd eerst beschreven door O'Farell 19 en uit de scheiding van eiwitten op basis van hun iso-elektrisch punt van iso-elektrische focussering in de eerste dimensie, en vervolgens naar hun molecuulgewicht van acrylamide gel elektroforese in de tweede dimensie. Door de resolutie en gevoeligheid van deze techniek is een krachtig hulpmiddel voor de analyse en detectie van eiwitten uit complexe biologische bronnen 19,20. Deze scheidingstechniek is beschikbaar als eiwit-centric aanpak met het grote voordeel van het oplossen eiwit isovormen veroorzaakt door post-transcriptionele modificaties of proteolytische bewerking. Kwantitatieve veranderingenkan worden gedetecteerd door vergelijking van de intensiteit van de overeenkomstige plek na kleuring van de gel 20. Echter is deze techniek niet geschikt voor de identificatie van zeer grote eiwitten, membraaneiwitten, zeer basische en zure of hydrofobe eiwitten, en is een enigszins moeizame en tijdrovende techniek 20. Nieuw peptide-centrische benadering (niet gel-gebaseerde) die robuuster en objectieve beschikbaar zijn en kunnen worden gebruikt voor kwantitatieve vergelijking van differentiële stabiele isotopen methoden zoals cysteïne etikettering isotoop gecodeerde affiniteit tagging (ICAT) 21 en aminogroep etikettering door isotoop tagging voor relatieve en absolute kwantificatie (iTRAQ) 22. Het gebruik van een enkele proteomics techniek kan onvoldoende informatie geven, daarom het gebruik van twee complementaire benaderingen proteomics is noodzakelijk voor de meeste volledig om veranderingen in de proteoom. Niettemin is 2-D gelelektroforese gebruikte en kan routinematig worden toegepast hoeveeltieve expressie van verschillende eiwitten in verschillende organismen.

Hier beschrijven we een whole-cell eiwitextractie en 2-D gel elektroforese procedures voor Burkholderia soorten die werden aangepast en geoptimaliseerd van de GE Healthcare 2-D elektroforese Principes en methoden Handboek 80-6429-60AC 2004 ( www.amershambiosciences.com ). Het eiwit extractie werd uitgevoerd met een kraal klopper glaskralen in aanwezigheid van PBS met 5 mM EDTA (ethyleendiaminetetra-azijnzuur) en 1 mM PMSF (fenylmethylsulfonylfluoride). Deze procedure maakt kwantificering van eiwitten met minimale degradatie en bewerkbaar voor proteomische benaderingswijzen zoals eerder gemeld 15,23,24. 2-D gelelektroforese werd uitgevoerd met 24 cm lang geïmmobiliseerde pH gradiënt 4-7 en eiwitten werden gescheiden op basis van hun iso-elektrisch punt. Daarna werden eiwitten gescheiden volgens hun Molecular gewicht door SDS-polyacrylamide gel. Verder beschrijven we een zilverkleuring werkwijze voor visualisatie van spot eiwitten en een zilverkleuring methode die compatibel massaspectrometrie analyse. Samen vormen deze procedures kunnen de identificatie van belangrijke eiwitten uit Burkholderia soorten die kunnen worden betrokken bij de pathogenese staan.

Protocol

1. Cultuur Groei (dagen 1 +2) Groeien een starter cultuur: 3 ml Luria Bertani (LB) bouillon in een handomdraai top 15 ml tube, bij 37 ° C gedurende de nacht rotator. Verdunnen groei gedurende de nacht om een OD 600 van 0,6. Voeg 1 ml van deze verdunning met 100 ml LB-medium in een 250 ml erlenmeyer. Incubeer bij 37 ° C onder schudden bij 250 rpm gedurende 16 uur in de stationaire fase (SP), een betere benadering, in batch cultuur, infectie omstandigheden onder controle van de stationaire fase sig…

Representative Results

Vergelijkende analyse van eiwitprofielen geëxtraheerd uit dezelfde bacteriecultuur op twee verschillende gelegenheden toonde vergelijkbare patronen streepvorming aangeeft succesvol eiwitextracties. Molecuulgewicht eiwitten geëxtraheerd varieerde 10-150 kDa. Figuur 1 toont representatieve Coomassie blauwkleuring gel van de gehele cel proteïne extracten uit Burkholderia multivorans (een lid van de BCC) klinische isolaten gekweekt in LB of gist / Manitol (YEM) bouillon en geoogst uit stationair…

Discussion

Werkwijze voor eiwitten preparaat beschreven dat de meeste Burkholderia eiwitten met goede reproduceerbaarheid kan halen. Dit wordt aangetoond door het verkrijgen van hetzelfde eiwit profiel van twee onafhankelijke preparaten uitgevoerd op verschillende dagen met dezelfde bacteriële kweek in LB bouillon of YEM zoals getoond in figuur 1. Extractie was efficiënt voor bacteriën gekweekt in vloeibare media, maar we hebben niet deze methode getest op bacteriën gekweekt op platen. Deze werkwijze …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door een studententijd van de Universiteit van British Columbia (naar BV) en subsidies van Cystic Fibrosis Canada en de Canadese Institutes of Health Research (DPS). Wij danken Jacqueline Chung voor de eerste voorbereidingen van protocollen.

Materials

Reagents
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626 Toxic, corrosive
Acetone Fisher A18-1 Flammable
PBS Buffer Bioscience R028
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher BP118-500 toxic
Glass beads (0.1 mm) BioSpec Products 11079101
Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) VWR 21009-342
MicroBCA protein extraction kit Pierce 23235
Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring Fisher 02-681-375
2-D Clean-Up kit GE Healthcare 80-6484-51
Urea Invitrogen 15505-050 Irritant
CHAPS Amersham Biosciences 17-1314-01
Dithiothreitol (DTT) MPBiomedical, LCC 856126 Irritant
Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm Amersham Biosciences 176002-46
Duracryl Proteomic Solutions 80-0148 Very toxic, carcinogen
Ammonium persulfate Fisher BP179-100 Flammable, toxic, corrosive
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) Invitrogen 15524-010 Flammable
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Acute toxicity, flammable
Agarose Invitrogen 15510-027
Ethanol Fisher HC1100-1GL Flammable, toxic
Acetic acid Fisher A491-212 Flammable, corrosive
Glutaraldehyde Fisher G151-1 Very toxic, corrosive, dangerous for the environment
Potassium tetrathionate Sigma P2926 Irritant
Sodium acetate EM Science 7510
Silver nitrate Sigma 209139 Corrosive, dangerous for the environment
Formaldehyde Sigma 252549 Toxic
Sodium thiosulfate Sigma S7026
Tris Base EMD 9230
Glycine MPBiomedical, LCC 808831
Glycerol MPBiomedical, LCC 800688
Methanol Fisher A412-4 Flammable, toxic, health hazard
Sodium carbonate anhydrous EMD SX0400-3 Toxic
Mineral oil ACROS 415080010
Equipment
JA-20 ultracentrifuge rotor Beckman Coulter 334831
Mini Beadbeater Biospec Products 3110BX
Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories GE Healthcare 80-6505-03 www.amershambiosciences.com
Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system GE Healthcare 80-6485-27 www.amershambiosciences.com

References

  1. Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).
  2. Suarez-Moreno, Z. R., et al. Common Features of Environmental and Potentially Beneficial Plant-Associated Burkholderia. Microb. Ecol. , (2011).
  3. Wiersinga, W. J., van der Poll, T., White, N. J., Day, N. P., Peacock, S. J. Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei. Nat. Rev. Microbiol. 4, 272-282 (2006).
  4. White, N. J. Melioidosis. Lancet. 361, 1715-1722 (2003).
  5. Mahenthiralingam, E., Urban, T. A., Goldberg, J. B. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nat. Rev. Microbiol. 3, 144-156 (2005).
  6. Speert, D. P., Henry, D., Vandamme, P., Corey, M., Mahenthiralingam, E. Epidemiology of Burkholderia cepacia complex in patients with cystic fibrosis. Canada. Emerg. Infect. Dis. 8, 181-187 (2002).
  7. Dance, D. A., Wuthiekanun, V., Chaowagul, W., White, N. J. The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment. J. Antimicrob. Chemother. 24, 295-309 (1989).
  8. Thibault, F. M., Hernandez, E., Vidal, D. R., Girardet, M., Cavallo, J. D. Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents. J. Antimicrob. Chemother. 54, 1134-1138 (2004).
  9. Govan, J. R. W., et al. Evidence for transmission of Pseudomonas cepacia by social contact in cystic fibrosis. Lancet. 342, 15-19 (1993).
  10. Thongboonkerd, V., et al. Altered proteome in Burkholderia pseudomallei rpoE operon knockout mutant: insights into mechanisms of rpoE operon in stress tolerance, survival, and virulence. J. Proteome. Res. 6, 1334-1341 (2007).
  11. Park, K. H., Lipuma, J. J., Lubman, D. M. Comparative proteomic analysis of B. cenocepacia using two-dimensional liquid separations coupled with mass spectrometry. Anal Chim. Acta. 592, 91-100 (2007).
  12. Wongtrakoongate, P., Mongkoldhumrongkul, N., Chaijan, S., Kamchonwongpaisan, S., Tungpradabkul, S. Comparative proteomic profiles and the potential markers between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Mol. Cell Probes. 21, 81-91 (2007).
  13. Harding, S. V., et al. The identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine. 25, 2664-2672 (2007).
  14. Madeira, A., Santos, P. M., Coutinho, C. P., Pinto-de-Oliveira, A., Sa-Correia, I. Quantitative proteomics (2-D DIGE) reveals molecular strategies employed by Burkholderia cenocepacia to adapt to the airways of cystic fibrosis patients under antimicrobial therapy. Proteomics. 11, 1313-1328 (2011).
  15. Zlosnik, J. E. A., Speert, D. P. The Role of Mucoidy in Virulence of Bacteria from the Burkholderia cepacia Complex: A Systematic Proteomic and Transcriptomic Analysis. J. Infect. Dis. 202, 770-781 (2010).
  16. Riedel, K., Carranza, P., Gehrig, P., Potthast, F., Eberl, L. Towards the proteome of Burkholderia cenocepacia H111: setting up a 2-DE reference map. Proteomics. 6, 207-216 (2006).
  17. Weiss, W., Gorg, A. Sample solublization buffers for two-dimensional electrophoresis. Methods Mol. Biol. 424, 35-42 (2008).
  18. von der Haar, T. Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts. PLoS One. 2, e1078 (2007).
  19. O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).
  20. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).
  21. Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags. J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).
  22. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
  23. Velapatiño, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis. Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).
  24. Chung, J. W., Speert, D. P. Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host. Microbiology. 153, 206-214 (2007).
  25. Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. Public health assessment of potential biological terrorism agents. Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).
  26. Thon, J. N., et al. Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches. Transfusion. 48, 425-435 (2008).
  27. Wu, T. In New and Emerging Proteomic Techniques. Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).
  28. Lopez, M. F., et al. A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling. Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).

Play Video

Cite This Article
Velapatiño, B., Zlosnik, J. E. A., Hird, T. J., Speert, D. P. Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species. J. Vis. Exp. (80), e50730, doi:10.3791/50730 (2013).

View Video