Summary

كله المشبك التصحيح الخلايا لدراسة آليات التحفيز العصبية الأشعة تحت الحمراء

Published: July 31, 2013
doi:

Summary

وقد اقترح تحفيز العصب تحت الحمراء كبديل للالتحفيز الكهربائي في مجموعة من أنواع العصبية، بما في ذلك تلك المرتبطة بالنظام السمعي. يصف هذا البروتوكول طريقة المشبك التصحيح لدراسة آلية تحفيز العصب الأشعة تحت الحمراء في ثقافة من الخلايا العصبية السمعية الأولية.

Abstract

وقد ثبت في السنوات الأخيرة أن نابض، ضوء ليزر الأشعة تحت الحمراء يمكن استخدامها لانتزاع استجابات الكهربائية في الأنسجة العصبية، مستقلة عن أي تعديل آخر على النسيج المستهدف. تم الإبلاغ عن التحفيز العصبي الأشعة تحت الحمراء في مجموعة متنوعة من الأنسجة العصبية الطرفية الحسية في الجسم الحي و، باهتمام خاص هو مبين في تحفيز الخلايا العصبية في العصب السمعي. ومع ذلك، في حين لم تظهر INS للعمل في هذه الأماكن، الآلية (أو الآليات) التي ضوء الأشعة تحت الحمراء يسبب الإثارة العصبية حاليا ليست مفهومة جيدا. بروتوكول المعروضة هنا يصف التصحيح خلية كاملة طريقة المشبك مصممة لتسهيل التحقيق في التحفيز العصبي الأشعة تحت الحمراء في مثقف الخلايا العصبية السمعية الأولية. بواسطة تميز بدقة استجابة هذه الخلايا إلى إضاءة ليزر الأشعة تحت الحمراء في المختبر تحت ظروف خاضعة للرقابة، قد يكون من الممكن للحصول على فهم أفضل للفيزيكا الأساسيةL والعمليات الكيميائية الحيوية التي تقوم عليها التحفيز العصبي الأشعة تحت الحمراء.

Introduction

مجالات الفسيولوجيا العصبية والطبية البيولوجية الالكترونية تعتمد بشكل كبير على التقنيات التي تسمح التحفيز يمكن السيطرة عليها من الاستجابات الكهربائية في الأنسجة العصبية. بينما التحفيز الكهربائي لا يزال المعيار الذهبي في الإثارة العصبية، أنها تعاني من عدد من السلبيات مثل وجود القطع الأثرية التحفيز عند تسجيل الاستجابات العصبية، وعدم وجود خصوصية التحفيز نظرا لانتشار الحالية إلى الأنسجة المحيطة 1.

شهدت خلال العقدين الماضيين تطوير بصريا تقنيات التحفيز بوساطة 2. العديد من هذه التقنيات تتطلب التعديل من الأنسجة المستهدفة، إما عن طريق إضافة جزيء معين (على سبيل المثال الجزيئات في قفص) 3 أو شكلا من أشكال التلاعب الجيني (على سبيل المثال optogenetics) لا من التي من السهل أن يطبق خارج إعداد البحوث. ذات أهمية خاصة لذلك هو التحفيز العصبي الأشعة تحت الحمراء (INS)، wherebهو متحمس Y الأنسجة العصبية بواسطة نابض ضوء الليزر تحت الحمراء. INS لديه القدرة على التغلب على كثير من أوجه القصور في التحفيز الكهربائي من خلال تمكين محددة للغاية، والتحفيز وعدم الاتصال من الأنسجة العصبية 2. ومع ذلك، فإنه بينما ثبت INS بنجاح في مجموعة متنوعة من إعدادات في الجسم الحي، وآلية دقيقة من الإثارة لا يزال غير مؤكد.

وقد أظهرت بعض المنشورات الحديثة التقدم نحو كشف آلية وراء INS 5-7. التسخين السريع بسبب امتصاص ضوء الليزر من قبل الماء ويبدو أن تلعب دورا رئيسيا. ومع ذلك، وراء هذا الإجماع لم يتحقق بعد. شابيرو وآخرون. 7 اقتراح آلية عامة للغاية حيث يسبب التسخين السريع اضطراب في توزيع الجسيمات المشحونة المتاخمة لغشاء الخلية، مما يؤدي إلى تغيير في السعة من غشاء الخلية والاستقطاب اللاحقة. وبالإضافة إلى ذلك، ألبرت وآخرون. 5 يؤكدون أن عالج بالليزرR الناجم عن التدفئة ينشط فئة معينة من درجة الحرارة القنوات الأيونية الحساسة (مستقبلات عابر قنوات الأنانداميد المحتملة)، والسماح لتمرير الأيونات عبر غشاء الخلية. في هذه المرحلة ليس واضحا كيف الجمع بين هذه الآليات، أو في الواقع ما إذا كانت هناك عدة عوامل أخرى لا يزال يتعين تحديدها.

على الرغم من أن عدد قليل من المطبوعات (المراجع 5،7-9) حققت INS في المختبر، وقد تم تنفيذ الغالبية العظمى من الأعمال المنشورة في هذا المجال في الجسم الحي (مثل المراجع 1،6،10-18). وقد تم تحفيز الأشعة تحت الحمراء من الخلايا العصبية السمعية وهي منطقة ذات أهمية خاصة، نظرا لالتطبيقات المحتملة في زراعة قوقعة 10،14-18. بينما في التجارب المجراة مهمة للتحقق من فعالية هذه التقنية في مختلف البيئات، وزيادة مستوى الرقابة التي يوفرها في الدراسات المختبرية ومن المتوقع أن يؤدي إلى فهم أكثر تفصيلا للالميكانيكيةanism المسؤولة عن INS. يصف هذا التقرير إعداد الخلايا العصبية مثقف العقدة الحلزونية للتحقيقات المشبك التصحيح، وهذه يمكن استخدامها لدراسة آليات الأساسية في سياق ربط أيضا إلى مجموعة كبيرة من البيانات الموجودة في الجهاز السمعي.

تقنية المشبك التصحيح هو أداة ممتازة لتحقيقات من الظواهر الكهربية، وتوفير وسيلة لتسجيل النشاط الكهربائي في الخلايا واحد ودراسة مساهمة التيارات الكامنة الفردية 19. عندما يتم تطبيق هذه التقنية لمستقر في إعداد المختبر من الخلايا العصبية الأولية، مثل الخلايا العصبية مثقف العقدة الحلزونية، فإنه يوفر الفرصة للدراسة في عمق الآليات التي يتم التحكم النشاط العصبي والتلاعب بها.

البروتوكولات المحددة في هذا العمل أساليب مخطط للتحقيق في تأثير التحفيز الليزر على الخصائص الكهربائية للخلايا العصبية العقدة الحلزونية من خلال التصحيح المشبكالتسجيلات. ويستند هذا النهج على الليزر الألياف الديناميكي بدلا من الليزر في الفضاء الحر، مما يسمح بتشغيل أكثر أمنا وكذلك أسهل وأكثر تكرار المواءمة دون الحاجة إلى تعديل تكوين المجهر القياسية. على أساس من هذه البروتوكولات، وينبغي أن يكون من الممكن إجراء مجموعة واسعة من التجارب من أجل تحديد أكثر وضوحا الآلية أو الآليات وراء INS.

Protocol

1. ثقافة من الخلايا العصبية العقدة الحلزونية تعقيم جولة صغيرة (مثل 10 مم) coverslips الزجاج وملقط المنحني في الأوتوكلاف. نقل coverslips على تعقيمها في الآبار الفردية العقيمة 4 حلقة 35 مم طبق بتري أو لوحة 4 بشكل جيد، وذلك باستخد?…

Representative Results

الخلايا العصبية العقدة الحلزونية الرد على الليزر الإضاءة مع تكرار الطول الموجي في كلا الجهد المشبك وتكوينات تسجيل الجاري المشبك. يبين الشكل 3A تغييرات نموذجية في تدفق التيار عبر غشاء الخلية استجابة ل2.5 ميللي ثانية، 0.8 ميغا جول ليزر النبض (متوسط ​​استجابة من…

Discussion

باستخدام البروتوكولات المذكورة في هذه الورقة أنه من الممكن استخراج والثقافة دوامة الخلايا العصبية العقدية والتحقيق الليزر أثار النشاط الكهربائي قبل تنفيذ كامل الخلية التصحيح التجارب المشبك. عندما تستخدم في المختبر، ويوفر تقنية المشبك التصحيح مستوى من السيطر…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل مجلس البحوث الأسترالي تحت ربط مشروع المنحة LP120100264.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Cell culture materials and equipment
Glass coverslips Lomb Scientific CSC 10 1 GP
4-ring cell culture dish VWR International 82050-542
Poly-L-ornithine solution Sigma-Aldrich P4957
Laminin Invitrogen 23017-015
Curved forceps WPI 14101 Dumont #5 tweezers (45° angle tip)
CO2 Incubator ThermoScientific Heracell 150i
Table 1. Cell culture materials and equipment.
Neurobasal media
Neurobasal A Gibco 10888-022
N-2 supplement Invitrogen 17502-048
B27 serum-free supplement Invitrogen 17504-044
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-148
L-Glutamine Invitrogen 25030-149
Intracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich G4500
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Na2ATP Sigma-Aldrich A2383
MgATP Sigma-Aldrich A9187
NaGTP Sigma-Aldrich G8877
Potassium hydroxide LabServ BSPPL738.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Extracellular solution
Sodium chloride Sigma-Aldrich 310166
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Calcium chloride Sigma-Aldrich 383147
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Sodium hydroxide LabServ BSPSL740.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.
Upright microscope Zeiss AxioExaminerD1 Equipped with Dodt contrast
Water-immersion objective Zeiss W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
Platform and X-Y stage ThorLabs Burleigh Gibraltar
Recording chamber Warner Instruments RC-26G
Vibration isolation table TMC Micro-g 63-532
CCD Camera Diagnostic Instruments RT1200
Camera software Diagnostic Instruments SPOT Basic
In-line solution heater Warner SH-27B
Temperature controller Warner TC-324B
Patch clamp amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Patch clamp data acquisition system Molecular Devices Digidata 1440A
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Micropipette glass Sutter Instruments GBF100-58-15 Borosilicate glass with filament
Micropipette Puller Sutter Instruments P2000
Recording Software AxoGraph Lab pack and electrophysiology tools
Aspirator bottle Sigma-Aldrich CLS12201L 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing
PE Tubing Harvard PolyE #340
Masterflex peristaltic pump Cole-Parmer HV-07554-85
Table 3.Patch clamp equipment.
1,870 nm laser diode Optotech
200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA
Optical fiber through connector (FC/PC) Thorlabs ADAFC2
Optical fiber cleaver EREM FO1
Optical fiber stripping tool (0.25 – 0.6 mm) Siemens For removing optical fiber jacket
Optical fiber stripping tool (0.6 – 1.0 mm) Siemens For removing outer coating of patch cord
Signal generator Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered
Optical fiber positioner Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments
Optical fiber chuck Newport FPH-DJ
Laser power meter and detector head Coherent FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)
Table 4. Laser equipment.

References

  1. Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003 (2005).
  2. Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).
  3. Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).
  4. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  5. Albert, E. S., et al. Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
  6. Wells, J., et al. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve. Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).
  7. Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
  8. Bec, J. -. M., et al. Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons. Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).
  9. Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).
  10. Izzo, A. D., et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth. Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).
  11. Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation. Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).
  12. Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique. Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).
  13. Jenkins, M. W., et al. Optical pacing of the embryonic heart. Nature Photonics. 4, 623-626 (2010).
  14. Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Laser stimulation of the auditory nerve. Lasers in Surgery and Medicine. 38, 745-753 (2006).
  15. Izzo, A. D., et al. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli. J. Biomed. Opt. 12, 021008 (2007).
  16. Richter, C. P., et al. Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening. Hearing Research. 242, 42-51 (2008).
  17. Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. Laser stimulation of single auditory nerve fibers. Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).
  18. Izzo, A. D., et al. Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  20. Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O’Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291, 1-14 (2012).
  21. Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).
  22. Whitlon, D. S., et al. Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion. 神经科学. 138, 653-662 (1016).
  23. Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice. Hearing Research. 230, 17-23 (2007).
  24. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. J. Vis. Exp. (36), e1685 (2010).
  25. Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 17, 075002 (2012).
  26. Snyder, A. W., Love, J. D. . Optical Waveguide Theory. , (1983).
  27. Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).
  28. Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies. Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).

Play Video

Cite This Article
Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation. J. Vis. Exp. (77), e50444, doi:10.3791/50444 (2013).

View Video