Um método simples e eficiente para detectar ativação do fator nuclear em neutrófilos humanos por citometria de fluxo

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue periférico ^1. Durante neutrófilos inflamação e infecção são as primeiras células a aparecer no local afetado, onde eles agem como a primeira linha de defesa ^2. Neutrófilos possuem vários mecanismos, incluindo antimicrobianos ³ fagocitose, produção de espécies reativas de oxigênio, liberação de enzimas líticas pela degranulação e produção de citocinas pró-inflamatórias ^4,5. Os neutrófilos são células de curta duração que são rapidamente ativadas através de sinalização de receptores de superfície vários celulares. Embora os neutrófilos foram consideradas células de terminal, devido à sua curta vida e porque eles sofrem apoptose, a menos que activada durante o processo inflamatório ^6, é agora evidente que pode também modificar o seu fenótipo, alterando o nível de transcrição de genes específicos. A produção de citocinas ⁵ e a inibição da apoptose ^7,8 são dois important funções de activação dependentes de células reguladas ao nível da transcrição dos neutrófilos. Factor nuclear kB (NF-kB) participa no controlo transcricional da produção de citoquina e ⁴ na regulação da sobrevivência celular e apoptose ^9-11 em vários tipos de células.

As vias de sinalização que levam à ativação do fator nuclear são estudados por ensaios de gene repórter ou por ensaios de mobilidade eletroforética turno (EMSA). No entanto, porque os neutrófilos são células de vida curta, o estudo das respostas transcricionalmente regulados nestas células não pode ser realizada com os ensaios de gene repórter, uma vez que não existem técnicas eficazes para a transfecção de neutrófilos. Ensaios de EMSA foram usados ​​em neutrófilos para explorar activação do factor nuclear ^12,13, no entanto, esta metodologia é complicada e dispendiosa uma vez que envolve a utilização de material radioactivo. Nucleofection é uma outra técnica que tem sido utilizada successfully para transfectar monócitos ^14. Assim, pelo menos em teoria, a activação do factor nuclear pode ser detectado nos neutrófilos por transfecção (apesar de baixa eficiência). No entanto, esta técnica poderia ser mais dispendioso, demorado e provavelmente menos quantitativo. A análise microscópica de células imunomarcadas também poderia ser usado para detectar factores nucleares no núcleo. Com efeito, temos detectado translocação de NF-kB para o núcleo deste modo ^15. Infelizmente, esta técnica também é demorada, menos quantitativos, e sujeita a viés do observador.

Aqui, apresentamos um método simples e eficiente, que permite a detecção e quantificação de fatores nucleares em núcleos isolados e immunolabeled por citometria de fluxo. Descrevemos técnicas para isolar os neutrófilos a partir de sangue periférico humano, estimular estas células via integrinas ou receptores de Fc com anti-anticorpos do receptor, isolar e núcleos immunolabel, e analisar os núcleos por citometria de fluxo (Figura 1). O método tem sido utilizado com sucesso para detectar a NF-kB ¹⁵ e Elk-1 ¹⁶ factores nucleares de núcleos de neutrófilos. A sensibilidade deste método permite a detecção de pequenas mudanças nos níveis do factor nuclear no núcleo. Este método também pode ser utilizado para analisar o nível de factores de transcrição no núcleo de outros tipos de células.