Summary

Простой и эффективный метод для обнаружения ядерных активация фактора в человеческих нейтрофилов с помощью проточной цитометрии

Published: April 09, 2013
doi:

Summary

Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов в крови. Нейтрофилы обладают транскрипционно регулируется функций, таких как производство провоспалительных цитокинов и торможению апоптоза. Эти функции могут быть изучены с методом, представленные здесь, которые позволяют обнаружения и количественного ядерного фактора методом проточной цитометрии в изолированных ядрах

Abstract

Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов в периферической крови. Эти клетки являются первыми появляются на участках воспаления и инфекции, став таким образом первой линией обороны против вторжения микроорганизмов. Нейтрофилы обладают важными антимикробной функции, такие как фагоцитоз, высвобождение литических ферментов, продукцию активных форм кислорода. В дополнение к этим важным функциям защиты, нейтрофилы выполнять другие задачи, в ответ на инфекцию, таких как производство провоспалительных цитокинов и торможению апоптоза. Цитокины привлечь другие лейкоциты, которые помогают очистить инфекции, и ингибирование апоптоза нейтрофилов позволяет жить дольше на месте инфекции. Эти функции регулируются на уровне транскрипции. Однако, так как нейтрофилы являются короткоживущими клетки, исследование транскрипционно регулируется ответы в этих клетках не может быть выполнено с традиционными методами генной репортер так как нет эффективностиcient методы нейтрофилов трансфекции. Здесь мы представляем простой и эффективный метод, который позволяет обнаружения и количественного ядерного фактора в изолированных и immunolabeled ядер методом проточной цитометрии. Мы описываем методы, чтобы изолировать чистую нейтрофилов периферической крови человека, стимулируют эти клетки с анти-антител к рецептору, изолировать и immunolabel ядер, ядер и анализа методом проточной цитометрии. Этот метод был успешно использован для обнаружения NF-kB и Elk-1 ядерных факторов в ядрах из нейтрофилов и других типов клеток. Таким образом, этот метод представляет собой вариант для анализа активации транскрипционных факторов в изолированных ядрах из различных типов клеток.

Introduction

Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов в периферической крови 1. Во время воспаления и инфекции нейтрофилы являются первыми клетками появляются на пораженные места, где они выступают в качестве первой линии обороны 2. Нейтрофилы обладают антимикробным несколько механизмов 3, включая фагоцитоз, продукцию активных форм кислорода, выделение литических ферментов дегрануляцию и производство провоспалительных цитокинов 4,5. Нейтрофилы являются недолговечными клеток, которые получают быстро активировать с помощью сигналов от различных рецепторов клеточной поверхности. Несмотря на то, нейтрофилы были рассмотрены терминала клеток из-за их короткой жизни, а потому, что они подвергаются апоптозу, если активированы во время воспалительного процесса 6, уже сейчас ясно, что они также могут изменить свой ​​фенотип, изменяя уровень транскрипции определенных генов. Продукции цитокинов 5 и ингибирование апоптоза 7,8 две яmportant-зависимой активации функции клеток регулируется на уровне транскрипции в нейтрофилах. Ядерный фактор кВ (NF-kB) участвует в транскрипционным контролем цитокинов 4 производственных и в регулировании выживания клеток и апоптоз 9-11 в различных типах клеток.

Сигнальных путей, которые ведут к ядерному активация фактора, как правило, изучаются анализы гена-репортера или сдвига электрофоретической подвижности анализы (EMSA). Однако, так как нейтрофилы являются короткоживущими клетки, исследование транскрипционно регулируется ответы в этих клетках не может быть выполнена с анализа гена-репортера, поскольку нет эффективных методов для нейтрофилов трансфекции. EMSA анализы были использованы в нейтрофилах, чтобы исследовать ядерный фактор активации 12,13, однако эта методология является сложной и дорогой, потому что она включает в себя использование радиоактивных материалов. Nucleofection является еще одним методом, который был использован successfuLLY для трансфекции моноциты 14. Таким образом, по крайней мере в теории, ядерной активация фактора могут быть обнаружены в нейтрофилах путем трансфекции (несмотря на низкую эффективность). Однако, этот метод был бы более дорогим, отнимающим много времени и, вероятно, менее количественные. Микроскопический анализ иммуноокрашиванию клетки могут быть также использованы для обнаружения ядерных факторов в ядре. Действительно, мы обнаружили NF-kB транслокации в ядро таким образом 15. К сожалению, этот метод также времени, меньше количественных и с учетом смещения наблюдателя.

Здесь мы представляем простой и эффективный метод, который позволяет обнаружения и количественного ядерного фактора в изолированных и immunolabeled ядер методом проточной цитометрии. Мы описываем методы, чтобы изолировать нейтрофилов периферической крови человека, стимулируют эти клетки через интегрины или Fc рецепторов с анти-антител к рецептору, изолировать и immunolabel ядер, ядер и анализ с помощью проточной цитометрии (Figure 1). Этот метод был успешно использован для обнаружения NF-kB 15 и Elk-1 16 ядерных факторов нейтрофилов ядер. Чувствительность этого метода позволяет обнаруживать небольшие изменения в ядерных уровней фактора в ядре. Этот метод также может быть использован для анализа уровня факторов транскрипции в ядрах от других типов клеток.

Protocol

1. Выделение нейтрофилов (ПМН) из крови человека Используйте около 20 мл крови человека с гепарином (10 ЕД / мл) в качестве антикоагулянта. Кровь была собрана из взрослых здоровых добровольцев venopuncture. Все эксперименты проводились при утверждении комитета по биоэтике при институте де-…

Representative Results

Способ очистки описаны здесь обычно обеспечивает нестимулированных нейтрофилов (ПМН) с чистотой более 95% (рис. 1А). Изолированные PMN может быть стимулировано путем сшивания частности рецепторов специфические моноклональные антитела. Мы стимулировали ПМН через рецепторы Fc и ин…

Discussion

Очистка метод, описанный здесь позволяет изоляции нестимулированных нейтрофилов (ПМН) с чистотой более 95% (оценка микроскопических наблюдений), в течение короткого времени. Иногда нейтрофилы могут быть загрязнены эритроцитов, если последний не лизируются полностью. Это обычно не влия?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Нэнси Мора за техническую помощь.

Эта работа финансировалась исследовательским грантам 48573-M и 168098 от Национального совета де Ciencia у Tecnologia, Мексика и грантов IN212308 и IN205311-2 от Direccion генерала де Asuntos дель Личные Academico, Национального автономного университета Мехико, Мексика.

Materials

REAGENTS
Heparin PiSA (Mexico)
Dextran T500 Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) T1-Dextran T500
Ficoll-Paque Pharmacia 17-0320-01
Sodium chloride Sigma S7653
Sodium phosphate monobasic Sigma S9638
Sodium phosphate dibasic Sigma S9390
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A2153 Cohn Fraction V
HEPES Sigma H3375
Potassium chloride Sigma P9541
Magnesium chloride anhydrous Sigma M8266
DL-dithiothreitol (DTT) Sigma D9163
Trypan Blue (0.4 % solution) Sigma T8154
Paraformaldehyde Sigma P6148
Triton X-100 Sigma X100
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 10437-028
Monoclonal antibody IV.3 Medarex (Annandale, NJ) 025-1 Human-specific anti-FcRII (CD32)
Monoclonal antibody 3G8 Medarex (Annandale, NJ) 028-2 Human-specific anti-FcRIII (CD16)
Monoclonal antibody TS2/16 Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) Donated by Dr. Martin Hemler Human-specific anti-β1 integrin (CD29)
Monoclonal antibody IB4 University of California, San Francisco Donated by Dr. Eric J. Brown Human-specific anti-β2 integrin (CD18)
F(ab’)2 goat anti-mouse IgG Cappel (Aurora, OH) 55468
FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-mouse IgG Cappel (Aurora, OH) 55522
FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG Cappel (Aurora, OH) 55665
Anti-NF-κB p50 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) sc-114 Rabbit polyclonal antibody
Anti-NF-κB p65 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) sc-109 Rabbit polyclonal antibody
EQUIPMENT
15-ml centrifuge tube Corning 430791
50-ml centrifuge tube Corning 430291
Centrifuge, Sorvall Tabletop Dupont Instruments RT 6000D
pH-meter Corning 340
Pipetman pipette P-20 Gilson F123600
Pipetman pipette P-200 Gilson F123601
Pipetman pipette P-1000 Gilson F123602
Hemocytometer Fisher Scientific 0267110
Microscope Nikon Eclipse E600
Inverted microscope Nikon TMS
Water Bath Incubator Fisher Scientific 2IS-M
Microcentrifuge Eppendorf 5414C
Microcentrifuge Eppendorf 5418
Flow Cytometer Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) FACScalibur

References

  1. Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
  2. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
  3. Naussef, W. M. How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view. Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).
  4. Scapini, P., et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).
  5. Hamilton, T., et al. Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression. J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).
  6. Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).
  7. Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Molecular control of neutrophil apoptosis. FEBS Lett. 487, 318-322 (2001).
  8. Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
  9. Green, D. R. Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge. Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).
  10. Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival. J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).
  11. Valente, P., et al. TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB. Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).
  12. Choi, M., et al. Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis. Blood. 102, 2259-2267 (2003).
  13. Wang, K., et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways. J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).
  14. Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).
  15. Garcia-Garcia, E., Rosales, C. Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method. J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).
  16. Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils. J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).

Play Video

Cite This Article
García-García, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410, doi:10.3791/50410 (2013).

View Video